SMA分子檢測進(jìn)展

SMA分子檢測進(jìn)展董欣生物化學(xué)與分子生物學(xué)

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進(jìn)行性近端型脊髓性肌肉萎縮癥，簡稱脊髓性肌肉萎縮癥（SpinalMuscularAtrophy）,SMA

SMA屬于常染色體隱性遺傳病，發(fā)病率為

1//6000-1/10000。

臨床上根據(jù)SMA發(fā)病年齡和病程的不同將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型

Ⅰ型（Werding-Hoffman?。?，又稱嚴(yán)重型SMA、急性型SMA、嬰兒型SMA，一般在兩歲之前死亡

Ⅱ型，又稱中間型，是一種中等程度的SMA，大多僅能存活兩年

Ⅲ型（Kugelberg-Welander?。址Q成人型，屬于輕型脊髓性肌萎縮癥，其發(fā)病年齡從一歲半至成年SMA相關(guān)基因運動神經(jīng)元生存基因——SMN

SMN基因定位于5號染色體長臂1區(qū)(sqll.2一13.3)近端粒SMNt(SMN1)近著絲粒SMNc(SMN2)兩者之間僅存在5個堿基的差距多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)MLPA的基本原理包括探針和靶序列DNA進(jìn)行雜交，之后通過連接、PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過毛細(xì)管電泳分離及數(shù)據(jù)收集，分析軟件對收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析最后得出結(jié)論。每個MLPA探針包括兩個熒光標(biāo)記的寡核苷酸片段，一個由化學(xué)合成，一個由M13噬菌體衍生法制備；每個探針都包括一段引物序列和一段特異性序列。在MLPA反應(yīng)中，兩個寡核苷酸片段都與靶序列進(jìn)行雜交，之后使用連接酶連接兩部分探針。連接反應(yīng)高度特異，只有當(dāng)兩個探針與靶序列完全雜交，即靶序列與探針特異性序列完全互補(bǔ)，連接酶才能將兩段探針連接成一條完整的核酸單鏈；反之，如果靶序列與探針序列不完全互補(bǔ)，即使只有一個堿基的差別，就會導(dǎo)致雜交不完全，使連接反應(yīng)無法進(jìn)行。連接反應(yīng)完成后，用一對通用引物擴(kuò)增連接好的探針，每個探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度都是唯一的，范圍在130～480bp。最后，通過毛細(xì)管電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，Genemarker軟件分析，得出結(jié)論。只有當(dāng)連接反應(yīng)完成，才能進(jìn)行隨后的PCR擴(kuò)增并收集到相應(yīng)探針的擴(kuò)增峰，如果檢測的靶序列發(fā)生點突變或缺失、擴(kuò)增突變，那么相應(yīng)探針的擴(kuò)增峰便會缺失、降低或增加，因此，根據(jù)擴(kuò)增峰的改變就可判斷靶序列是否有拷貝數(shù)的異?；螯c突變存在?，F(xiàn)有的分子診斷方法半定量PCRFISH熒光實時定量PCRPCR-RFLPPCR-SSCPMLPA多重PCR結(jié)合DHPLC等。應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)檢測SMASMA患者SMN1基因具有第7,8號外顯子的缺失，而SMN2未見缺失

聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR-SSCP）PCR擴(kuò)增特定靶序列

將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

因遷移率變化會出現(xiàn)泳動變位，從而可將變異DNA與正常DNA區(qū)分開應(yīng)用PCR-RFLP法診斷SMA

PCR-RFLP法是一種簡單、快速的診斷方法

PCR-RFLP的基本原理是用PCR擴(kuò)增目的

DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。

在差異堿基相鄰處通過反向錯配引物引入錯配位點T(原序列為C)，從而在SMN2的PCR產(chǎn)物中形成1個特異的DraI酶切位點

通過Dral對SMN1與SMN2的第7外顯子PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接酶切以區(qū)別SMN1和SMN2

SMN1的第7外顯子PCR產(chǎn)物(189bp)不被酶切，而SMN2的第7外顯子的PcR產(chǎn)物可被酶切，變成

165bP和24bP片段。以PCR-RFLP為例，酶切不完全和PCR擴(kuò)增時形成SMNI和SMN2之間形成的異源雙鏈都會造成假陰性結(jié)果;擴(kuò)增阻滯PCR也存在非特異擴(kuò)增和擴(kuò)增失敗等問題。展望 SMA分子診斷方法的多樣性證明，每種分子診斷方法都不可避免地會有它自身的局限性。SMA分子診斷技術(shù)尚有待進(jìn)一步完善。 相信隨著SMA基因檢測的廣泛開展，SMA分