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文檔簡介
熒光定量PCRreal
time-PCR定量PCR反應體系①actin③achialy⑦vlg⑨stat②actin④achi⑥aly⑧vlg⑩stat模板cDNA4ul1♀模板2♂模板Tag
mixture10ul③ ⑦
⑨443.45ng/ul686.75ng/ul引物10.5ul①引物20.5ul②④
⑥
⑧
⑩17.738ng/ul26.47ng/ulH205ul定量與常規(guī)PCR的差別常規(guī)PCR技術:
對PCR擴增反應的終產物進行定量及定性分析定量PCR技術:
通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時
檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析三個關鍵詞:實時,定量,熒光PCR分四個階段如何定量?Ct值的概念
Ct值的定義是PCR擴增過程中,熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環(huán)次數。定量原理確定初始模板的濃度?初始DNA量越多,熒光達到某一值(域值)時所需要的循環(huán)數越少?Log濃度與循環(huán)數呈線性關系,根據樣品擴增達到域值的循環(huán)數就可計算出樣品中所含的模板量起點定量與終點定量熒光化學?SYBR
Green
1?
TaqManTaqManSYBR
Green
I工作原理TC
A
G
C
A
CG
GT
G
C
T
C
T
AG
A
T
G
G
A
T
C
C
A
T
G。SYBR
Green
1
結合到雙鏈DNA的小溝部位SYBR
Green
1
染料只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光A
C
G
AT
G
C
TCG
AC
A
T
G
T
C
A
G
C
AT
C
C
T
A
CG
T
GG
ACT
A
G
G
A
T
G
GT
A
C
A
G
T
CC
C
T
A變性:無熒光信號A
C未結合SYBR
Green
1
dyeSYBR
Green
I應用范圍起始模板濃度定量融解曲線分析–---可區(qū)分單一產物、變異產物、多種產物和(或)引物二聚體基因型分析SYBR
Green
I
優(yōu)點SYBR
Green
I
缺點PCR程序指南UN
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