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文檔簡介

熒光定量PCRreal

time-PCR定量PCR反應體系①actin③achialy⑦vlg⑨stat②actin④achi⑥aly⑧vlg⑩stat模板cDNA4ul1♀模板2♂模板Tag

mixture10ul③ ⑦

⑨443.45ng/ul686.75ng/ul引物10.5ul①引物20.5ul②④

⑥

⑧

⑩17.738ng/ul26.47ng/ulH205ul定量與常規(guī)PCR的差別常規(guī)PCR技術：

對PCR擴增反應的終產物進行定量及定性分析定量PCR技術：

通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時

檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析三個關鍵詞：實時，定量，熒光PCR分四個階段如何定量？Ct值的概念

Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環(huán)次數。定量原理確定初始模板的濃度?初始DNA量越多,熒光達到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數越少?Log濃度與循環(huán)數呈線性關系，根據樣品擴增達到域值的循環(huán)數就可計算出樣品中所含的模板量起點定量與終點定量熒光化學?SYBR

Green

1?

TaqManTaqManSYBR

Green

I工作原理TC

A

G

C

A

CG

GT

G

C

T

C

T

AG

A

T

G

G

A

T

C

C

A

T

G。SYBR

Green

1

結合到雙鏈DNA的小溝部位SYBR

Green

1

染料只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光A

C

G

AT

G

C

TCG

AC

A

T

G

T

C

A

G

C

AT

C

C

T

A

CG

T

GG

ACT

A

G

G

A

T

G

GT

A

C

A

G

T

CC

C

T

A變性:無熒光信號A

C未結合SYBR

Green

1

dyeSYBR

Green

I應用范圍起始模板濃度定量融解曲線分析–---可區(qū)分單一產物、變異產物、多種產物和（或）引物二聚體基因型分析SYBR

Green

I

優(yōu)點SYBR

Green

I

缺點PCR程序指南UN

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