分子發(fā)光分析

第4章分子發(fā)光分析（MolecularLuminescenceAnalysis）4.1分子熒光及磷光分析一、基本原理

1.分子能級、熒光及磷光的產(chǎn)生

2.去活化過程

3.定性分析

4.影響熒光及熒強(qiáng)度的因素

5.定量分析二、熒光儀器三、磷光分析

1.磷光的特點(diǎn)：

2.低溫?zé)晒?/p>

3.室溫?zé)晒?/p>

4.磷光儀器熒光：16世紀(jì)：在礦物和植物提取液中發(fā)現(xiàn)熒光；1575年：Monardes——植物愈創(chuàng)木切片黃色水溶液——天蘭色熒光；1852年：Stokes闡明熒光發(fā)射機(jī)制（分光計觀測奎寧和葉綠素的熒光，發(fā)現(xiàn)波長稍長于入射光的波長——認(rèn)識到熒光為“重新發(fā)光”而不是漫射光；1905年：Wood發(fā)現(xiàn)氣體分子的共振熒光；1926年:Gaviola直接測定了熒光壽命；1923年：熒光X射線光譜；1964年：原子熒光光譜分析的建立；1965年：熒光分析在生物分析中廣泛應(yīng)用；磷光：15世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)（重晶石在強(qiáng)烈陽光下的發(fā)光）1944年：Lewis提出磷光用于分析的可能性；1957年：Keirs將磷光分析用于定量分析及多組份混合物分析；1963年：廣泛用于血液及尿液中痕量藥物及農(nóng)藥殘留量分析；特點(diǎn)：靈敏度高（1-100ppb)：有的可達(dá)0.01ppb。WHY??熒光靈敏度除待測物濃度有關(guān)外，還與入射光強(qiáng)度及光度計靈敏度有關(guān)；選擇性好方法簡單快速，用樣量少應(yīng)用不太廣泛。4.1分子熒光分析及磷光分析一、基本原理分子發(fā)光：處于基態(tài)的分子吸收能量（電、熱、化學(xué)和光能等）被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象稱為發(fā)光。發(fā)光分析包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光等。物質(zhì)吸收光能后所產(chǎn)生的光輻射稱之為熒光和磷光。1.分子能級、熒光及磷光的產(chǎn)生分子能級=電子能級(Ee)+振動能級(Ev)+轉(zhuǎn)動能級(Er)。其中電子能級包含振-轉(zhuǎn)能級，如圖。基態(tài)：電子自旋配對，多重度=2s+1=1，為單重態(tài)，以S0表示。激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋仍然配對，為單重態(tài)，稱為激發(fā)單重態(tài)，以S1，S2…表示激發(fā)三重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋不再配對，為三重態(tài)，稱為激發(fā)三重態(tài)，以T1，T2….表示。三重態(tài)能級低于單重態(tài)（Hund規(guī)則）2.去活化過程（Deactivation）

處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態(tài)。這些過程包括：1）振動弛豫（VibrationalRelaxation,VR）在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，從而從高振動能層失活至低振動能層的過程，稱為振動弛豫。2）內(nèi)轉(zhuǎn)換（InternalConversion，IC）對于具有相同多重度的分子，若較高電子能級的低振動能層與較低電子能級的高振動能層相重疊時，則電子可在重疊的能層之間通過振動耦合產(chǎn)生無輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。3）外轉(zhuǎn)換（ExternalConversion，EC）受激分子與溶劑或其它分子相互作用發(fā)生能量轉(zhuǎn)換而使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失的過程，也稱“熄滅”或“猝滅”。4）系間跨躍（IntersystemConversion，ISC）系間跨躍是發(fā)生在兩個不同多重態(tài)之間的無輻射躍遷，如從S1到T1，該躍遷是禁阻的。然而，當(dāng)不同多重態(tài)的兩個電子能層有較大重疊時，處于這兩個能層上的受激電子的自旋方向發(fā)生變化，即可通過自旋-軌道耦合而產(chǎn)生無輻射躍遷，該過程稱為系間跨躍。

5）熒光發(fā)射分子電子從單重激發(fā)態(tài)（Kasha規(guī)則）的最低振動能級在很短時間（10-9-10-6s）躍遷到基態(tài)各振動能層時所產(chǎn)生的光子輻射稱為熒光。由于各種去活化過程的存在，熒光輻射能通常要比激發(fā)能量低，或者說，熒光波長大于激發(fā)波長（Stokes效應(yīng)）。6）磷光發(fā)射從單重態(tài)到三重態(tài)分子間發(fā)生系間跨躍躍遷后，再經(jīng)振動弛豫回到三重態(tài)最低振動能層，最后，在10-4-10s內(nèi)躍遷到基態(tài)的各振動能層所產(chǎn)生的輻射。3.定性分析任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒（磷）光定性分析的基礎(chǔ)。1）激發(fā)光譜改變激發(fā)波長，測量在最強(qiáng)熒（磷）光發(fā)射波長處的強(qiáng)度變化，以激發(fā)波長對熒光強(qiáng)度作圖可得到激發(fā)光譜。激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因?yàn)榉肿游展饽艿倪^程就是分子的激發(fā)過程。激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)；在定量時，用于選擇最適宜的激發(fā)波長。2）發(fā)射光譜發(fā)射光譜即熒光光譜。一定波長和強(qiáng)度的激發(fā)波長輻照熒光物質(zhì)，產(chǎn)生不同波長的強(qiáng)度的熒光，以熒光強(qiáng)度對其波長作圖可得熒光發(fā)射光譜。由于不同物質(zhì)具不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。如右圖所示。激發(fā)光譜熒光光譜磷光光譜3）激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系i）波長比較與激發(fā)（或吸收）波長相比，熒光發(fā)射波長更長，即產(chǎn)生所謂Stokes位移。（振動弛豫失活所致）ii）形狀比較熒光光譜形狀與激發(fā)波長無關(guān)。盡管分子受激后可到達(dá)不同能層的激發(fā)態(tài)，但由于去活化（內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫）到第一電子激發(fā)態(tài)的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達(dá)第一激發(fā)態(tài)一樣。換句話說，不管激發(fā)波長如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能層躍遷到基態(tài)的各個振動能層。iii）鏡像對稱通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對稱關(guān)系。解釋1：能層結(jié)構(gòu)相似性熒光為第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動能層躍遷到基態(tài)的各個振動能層而形成，即其形狀與基態(tài)振動能級分布有關(guān)。吸收光譜是由基態(tài)最低振動能層躍遷到第一電子激發(fā)單重態(tài)的各個振動能層而形成，即其形狀與第一電子激發(fā)單重態(tài)的振動能級分布有關(guān)。由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的振動能層分布具有相似性，因而呈鏡像對稱。S1S0解釋2：位能曲線（Frank-Condon原理）

由于電子吸收躍遷速率極快（10-15s），此時核的相對位置可視為不變（核較重）。當(dāng)兩個能層間吸收躍遷的幾率越大，其相反躍遷的幾率也越大，即產(chǎn)生的光譜呈鏡像對稱。4.影響熒光及熒光強(qiáng)度的因素產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；ii）吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定量子效率的熒光。即量子效率

足夠大：可見，凡是使kF增加，使其它去活化常數(shù)降低的因素均可增加熒光量子產(chǎn)率。通常，kF由分子結(jié)構(gòu)決定（內(nèi)因），而其它參數(shù)則由化學(xué)環(huán)境和結(jié)構(gòu)共同決定。下面討論影響熒光及強(qiáng)度的因素。

1）躍遷類型：通常，具有

—*及n—*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才會產(chǎn)生熒光。而且具

—*躍遷的量子效率比n—*躍遷的要大得多（前者大、壽命短、kISC?。?。2）共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光越強(qiáng)。3）剛性結(jié)構(gòu)：分子剛性（Rigidity）越強(qiáng)，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高。

如熒光素（大）與酚酞（=0）；芴（=1）與聯(lián)苯（=0.18）。4）取代基：

給電子取代基增強(qiáng)熒光（p-共軛），如-OH、-OR、

-NH2、-CN、NR2等；吸電子基降低熒光，如-COOH、

-C=O、-NO2、-NO、-X等；重原子降低熒光但增強(qiáng)磷光，如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)。內(nèi)因5）溶劑效應(yīng)：溶劑極性可增加或降低熒光強(qiáng)度（改變

—*及

n—*

躍遷的能量）；與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強(qiáng)度。6）溫度：溫度增加，熒光強(qiáng)度下降（因?yàn)閮?nèi)、外轉(zhuǎn)換增加、粘度或“剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。7）pH值：具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同pH值時，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變；對無機(jī)熒光物質(zhì)，因pH值會影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。8）內(nèi)濾光和自吸：體系內(nèi)存在可以吸收熒光的物質(zhì)，或熒光物質(zhì)的熒光短波長與激發(fā)光長波長有重疊，均可使熒光強(qiáng)度下降，稱為內(nèi)濾光；當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時，可吸收自身的熒光發(fā)射，稱為熒光自吸。9）熒光猝滅：碰撞猝滅；靜態(tài)猝滅；轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅；電子轉(zhuǎn)移猝滅；自猝滅。5.定量分析二、熒光儀器（光源與檢測器處于相互垂直的位置）第一單色器或?yàn)V光片記錄儀第二單色器或?yàn)V光片熒光光源激發(fā)樣品池1）光源：氙燈、高壓汞燈、激光；2）樣品池：石英（低熒光材料）；3）兩個單色器：選擇激發(fā)光單色器；分離熒光單色器；4）檢測器：光電倍增管。熒光分析的特點(diǎn)：靈敏度高：視不同物質(zhì)，檢測下限在0.1~0.001g/mL之間?？梢姳萓V-Vis的靈敏度高得多！WHY？選擇性好：可同時用激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜定性。結(jié)構(gòu)信息量多：包括物質(zhì)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強(qiáng)、熒光量子效率、熒光壽命等。應(yīng)用不廣泛：主要是因?yàn)槟馨l(fā)熒光的物質(zhì)不具普遍性、增強(qiáng)熒光的方法有限、外界環(huán)境對熒光量子效率影響大、干擾測量的因素較多。三、磷光分析1.磷光的特點(diǎn)：

磷光波長比熒光的長(T1<S1)；

磷光壽命比熒光的長(磷光為禁阻躍遷產(chǎn)生，速率常數(shù)小)；

磷光壽命和強(qiáng)度對重原子和氧敏感(自旋軌道耦合，使kISC增加)。2.低溫磷光（液氮）由于磷光壽命長，T1的非輻射躍遷（內(nèi)轉(zhuǎn)換）幾率增加，碰撞失活（振動弛豫）的幾率、光化學(xué)反應(yīng)幾率都增加，從而降低磷光強(qiáng)度。因此有必要在低溫下測量磷光。同時要求溶劑：易提純且在分析波長區(qū)無強(qiáng)吸收和發(fā)射；低溫下形成具足夠粘度的透明的剛性玻璃體。常用的溶劑：

EPA——乙醇+異戊烷+二乙醚（2+2+5）

IEPA——CH3I+EPA（1+10）。3.室溫磷光低溫?zé)晒庑璧蜏貙?shí)驗(yàn)裝置且受到溶劑選擇的限制，1974年后發(fā)展了室溫磷光（RTP）。1）固體基質(zhì)：在室溫下以固體基質(zhì)（如纖維素等）吸附磷光體，增加分子剛性、減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷