膝溝藻毒素2和3的毛細(xì)管電泳法分析

膝溝藻毒素2和3的毛細(xì)管電泳法分析

海洋貝類素的出現(xiàn)與海洋環(huán)境密切相關(guān)。在發(fā)現(xiàn)的幾種貝類毒素中，麻痹性貝類素（psp）是世界上最常見的。PSP是一類主要由赤潮藻類產(chǎn)生、帶有胍基的三環(huán)氨基甲酸脂類酸穩(wěn)定性小分子化合物。據(jù)報(bào)道,PSP是大亞灣海域及廣東沿海中常見的貝類毒素,其中膝溝藻毒素(gonyautoxin,GTX)、neoSTX、C1和C2等均有在沿岸貝類和藻類中被發(fā)現(xiàn)的報(bào)道,GTX2和GTX3的毒性較強(qiáng)也較為常見。制備針對GTX2&3乃至針對大部分麻痹性貝毒的特異性抗體,是生產(chǎn)PSP快速檢測試劑盒的關(guān)鍵。本文建立了GTX2&3高效毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)分析系統(tǒng),對作為免疫原的GTX2&3樣品進(jìn)行了分析和定量,而GTX2&3的定量是這種半抗原與載體進(jìn)行有效連接和相關(guān)特異性抗體篩選的必要條件。1材料和方法1.1適合我國樹立的抗菌體質(zhì)量所用儀器包括P/ACETMMDQ型高效毛細(xì)管電泳儀(BECKMANCOULTER,USA),紫外檢測器,熔融石英毛細(xì)管(河北省永年銳灃光纖科技公司),Orion410A型精密pH計(jì)(USA)。麻痹性貝類毒素GTX2&3(NRC-CRM-GTX2&3-b)標(biāo)準(zhǔn)品購自加拿大國家研究院海洋研究所,免疫用GTX2&3樣品贈自某國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。其它化學(xué)試劑有:磷酸氫二鈉和檸檬酸(汕頭市光華化學(xué)廠,分析純),36%醋酸(廣州市海珠區(qū)化學(xué)試劑廠,分析純),醋酸鈉(廣東光華化學(xué)廠,分析純)。1.2有效長度和有效長度沖洗及運(yùn)行緩沖液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。毛細(xì)管75μm×40cm,有效長度為30cm。分離電壓6kv,溫度25℃,壓力進(jìn)樣(0.5psi,5s),紫外檢測波長為200nm。1.3檢測采用不同的pH值(分別為3.0,4.0,5.0,6.0)、不同的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液濃度(75,37.5,18.8mmol/L)、不同的分離電壓(7,6,5kv),對NRC-CRM-GTX2&3-b標(biāo)準(zhǔn)GTX2&3毒素進(jìn)行檢測。1.4精密度、標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限采用37.5mmol/L,pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為運(yùn)行緩沖液,對GTX2濃度分別為118.0,59.0,29.5,14.6,5.6,1.3和0.5μmol/L;GTX3濃度分別為39.0,19.5,9.8,4.9,2.1,0.5和0.2μmol/L的NRC-CRM-GTX2&3-b進(jìn)行檢測,繪制峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。并測定日內(nèi)及日間檢測精密度。用鹽酸-醋酸溶液(3mmol/L鹽酸,10mmol/L醋酸)按1∶10及1∶20的比例稀釋GTX2&3免疫原,每個樣品檢測3次。NRC-CRM-GTX2&3-b(118.0μmol/L)和GTX2&3-b免疫原(1∶20稀釋)按1∶1體積混勻,連續(xù)檢測3次。2結(jié)果2.1在32kv時,電泳圖譜的穩(wěn)定性經(jīng)不同pH值、不同運(yùn)行緩沖液濃度和不同分離電壓的測試,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液濃度為37.5mmol/L、pH值為5.0、分離電壓為6kv時,電泳圖譜的基線最為平整,噪音較低,兩個峰的間隔較為適中(圖1)。出峰時間為8.2~8.5min的峰為GTX2吸收峰,8.6~8.9min的峰是GTX3的吸收峰。在約11min處有一個醋酸根離子的負(fù)吸收峰。2.2方法的檢測限和準(zhǔn)確度對系列稀釋濃度的NRC-CRM-GTX2&3-b標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測后,結(jié)果表明GTX2濃度在0.5~118.0μmol/L時,其峰面積與質(zhì)量濃度之間有良好的線性關(guān)系,直線方程為Y=0.0004964X+0.081476,直線相關(guān)系數(shù)(r2)為0.9984,最低檢測限為0.38μmol/L(按S/N=3計(jì)算);GTX3濃度在0.5~39.0μmol/L時,其峰面積與質(zhì)量濃度之間有良好的線性關(guān)系,直線方程為Y=0.0004074+0.027997,直線相關(guān)系數(shù)(r2)為0.9986,最低檢測限為0.36μmol/L(按S/N=3計(jì)算)。取NRC-CRM-GTX2&3-b標(biāo)準(zhǔn)品作兩倍稀釋,進(jìn)行日內(nèi)和日間的連續(xù)測定,測得日內(nèi)精密度是:GTX2的濃度是58.7±1.5μmol/L,RSD為2.5%(n=12);GTX3的濃度是19.2±0.5μmol/L,RSD為2.6%(n=12)。日間精密度是:GTX2的濃度是58.5±3.3μmol/L,RSD為5.6%(n=8);GTX3的濃度是19.5±1.3μmol/L,RSD為6.3%(n=8)。2.3麻黃的n和8.9min峰面積在8.5~10min之間,GTX2&3免疫原有4個明顯的吸收峰(圖2a),將免疫原樣品與NRC-CRM-GTX2&3-b標(biāo)準(zhǔn)品混勻后,8.5min和8.9min兩個峰的峰面積明顯增加(圖2b),表明GTX2&3免疫原的這兩個吸收峰與NRC-CRM-GTX2&3-b標(biāo)準(zhǔn)品的GTX2與GTX3的兩個吸收峰發(fā)生了疊加。根據(jù)8.5min的峰面積及GTX2標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出GTX2&3免疫原中GTX2的濃度為325.8±32.8μmol/L(n=3);依據(jù)8.9min的峰面積及GTX3標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出GTX2&3免疫原中GTX3的濃度為287.6±15.1μmol/L(n=3)。3檢測限和定量限Thibault等建立的GTX2&3CE檢測系統(tǒng)中使用的嗎啉價格較貴,本文首次利用價格便宜的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖系統(tǒng)作為CE運(yùn)行緩沖液來檢測GTX2&3,獲得了較低的檢測限(GTX20.38μmol/L,GTX30.36μmol/L)和較為滿意的線性檢測范圍。這個檢測方法的建立,不但使作為免疫原的GTX2&3樣品得到較好的定量,而且也極有可能應(yīng)用于海產(chǎn)品中污染GTX2&3的定性和定量檢測。本文所使用的GTX2&3免