人神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷大鼠后路運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響

人神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷大鼠后路運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響

隨著競(jìng)技體育的發(fā)展，場(chǎng)上性道路事故已成為除道路事故和建筑物事故外的另一個(gè)重要因素。脊髓損傷常遺留嚴(yán)重的殘疾,約半數(shù)SCI患者出現(xiàn)四肢癱瘓,嚴(yán)重影響患者生活自理能力和生活質(zhì)量。研究表明,胚胎源性干細(xì)胞移植能夠一定程度地改善脊髓損傷大鼠的后肢功能,但胚胎源性干細(xì)胞的多向分化潛能為SCI患者治療的不確定性埋下隱患。神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells,NSCs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)新生細(xì)胞的源泉,具有向中樞神經(jīng)細(xì)胞分化的先天優(yōu)勢(shì),在體外能分化為神經(jīng)元,為SCI的干細(xì)胞移植治療提供新的細(xì)胞來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)以人神經(jīng)干細(xì)胞(hNSCs)為研究對(duì)象,觀察hNSCs移植對(duì)胸段脊髓打擊損傷模型大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響,并初步探討其作用機(jī)理,為進(jìn)一步采用hNSCs移植治療SCI患者的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.2小鼠海馬區(qū)的dmem/fpse人神經(jīng)干細(xì)胞自孕2~3個(gè)月流產(chǎn)胎兒海馬區(qū)組織中分離培養(yǎng)。細(xì)胞的獲取得到當(dāng)事人知情同意,并獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)許可。嚴(yán)格無(wú)菌條件下取胎齡為2~3個(gè)月的流產(chǎn)胎兒海馬區(qū)組織,置于含4℃磷酸緩沖液的培養(yǎng)皿中,顯微鏡下細(xì)心剝除血管和筋膜,剪碎海馬區(qū)組織,0.125%胰酶和0.04%DNaseⅠ消化20min,終止消化后,經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液,接種到含B27、EGF、bFGF的無(wú)血清DMEM/F12的培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)12天的原代神經(jīng)球采用機(jī)械吹打,并結(jié)合酶消化制成單細(xì)胞懸液,以1×108/L細(xì)胞密度接種培養(yǎng),每2周左右傳代一次。1.3小鼠單克隆抗體hnsc的檢測(cè)Nestin細(xì)胞免疫熒光鑒定:取生長(zhǎng)良好的人神經(jīng)干細(xì)胞接種于置有經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞在蓋玻片上貼壁3~5h后用來(lái)鑒定:PBS洗滌3次,5min/次;4%多聚甲醛固定30min,PBS洗滌3次,5min/次;3%過(guò)氧化氫室溫下浸泡10min;0.1%TritonX-100常溫下孵育10min,PBS洗滌3次,5min/次;正常山羊血清封閉液(即用型)37℃孵育30min,甩干不洗;滴加小鼠抗人Nestin單克隆抗體200μl(1∶200稀釋),4℃過(guò)夜;滴加羊抗小鼠IgG-FITC100μl(1∶500稀釋),37℃孵育30min后,熒光顯微鏡下觀察、拍照。移植前1天,機(jī)械打散呈神經(jīng)球狀懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞后,將hNSC進(jìn)行CM-DiI標(biāo)記。標(biāo)記成功后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010/L保存于DMEM/F12培養(yǎng)液中準(zhǔn)備移植。1.4髓傷模型的制作采用通用型脊髓打擊器建立大鼠脊髓損傷模型。成年雌性SD大鼠24只,10%水合氯醛3~4ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉,背部正中切口,暴露第9~11胸椎椎板,用顯微剪將T10全椎板切除暴露脊髓。通用型脊髓打擊器10g重錘自5cm高度處自由下落,制成T10段脊髓損傷模型,打擊后脊髓即刻出血、腫脹,大鼠雙下肢抽搐,尾巴甩動(dòng),隨后完全松弛。圍手術(shù)期肌注青霉素20萬(wàn)IU/kg預(yù)防感染,連續(xù)3d;并定時(shí)進(jìn)行膀胱按摩,協(xié)助排便。傷后第8天隨機(jī)分為移植組和對(duì)照組,每組12只。脊髓損傷后1周內(nèi)2只動(dòng)物死亡,移植后3只動(dòng)物死亡。移植組10只、對(duì)照組9只進(jìn)入結(jié)果分析。1.5cmdii標(biāo)記的人神經(jīng)干細(xì)胞懸液的注入脊髓損傷后第8天,移植組大鼠沿原手術(shù)切口暴露損傷脊髓,將采用CM-DiI標(biāo)記的人神經(jīng)干細(xì)胞懸液5μl直接用微量注射器多點(diǎn)緩慢注入到脊髓損傷處,總細(xì)胞數(shù)約5×104個(gè)。對(duì)照組則給予5μl不含細(xì)胞的DMEM/F12培養(yǎng)液。1.6運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分將大鼠放入一固定場(chǎng)所,通過(guò)觀察大鼠后肢運(yùn)動(dòng)、軀干位置及穩(wěn)定性、步態(tài)協(xié)調(diào)性、爪的位置、足趾間隙及尾的位置等,采用Basso,Beattie,Bresnahan(BBB)行為功能評(píng)定量表評(píng)定大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能。正常大鼠BBB評(píng)分為21分。脊髓損傷后1d,主要靠前肢拖著身體移動(dòng),腹部貼地,雙后肢運(yùn)動(dòng)功能喪失,雙足底向上呈不負(fù)重狀,大小便失禁,BBB評(píng)分為0分。分別于細(xì)胞移植當(dāng)天及移植后1、2、3、4、6、8周,由兩名熟悉BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的非本組實(shí)驗(yàn)人員實(shí)行盲法評(píng)分。1.7gfap、neun、cnpase、nist的表達(dá)遷移分別于hNSCs移植后第4、8周,每組采用深部麻醉下安樂(lè)處死4只動(dòng)物,于損傷中心頭尾側(cè)各1cm處切斷脊髓,迅速包埋,連續(xù)冰凍切片厚約4μm。熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞的存活和遷移,以及檢測(cè)移植組織內(nèi)GFAP、NeuN、CNPase、Nestin的表達(dá)。具體步驟如下:將冰凍切片室溫下干燥20min,冷丙酮固定10min后風(fēng)干;3%過(guò)氧化氫溶液浸泡20min,阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;正常山羊封閉血清37℃封閉30min;滴加Nestin、NeuN、CNPase、GFAP一抗(1∶200稀釋)50μl,4℃濕盒中過(guò)夜,陰性對(duì)照以PBS代替一抗;滴加羊抗小鼠熒光二抗FITC(1∶500稀釋)50μl,37℃孵育60min;水性封片劑封片;激光共聚焦顯微鏡下觀察。余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于本實(shí)驗(yàn)結(jié)束后安樂(lè)處死。1.8統(tǒng)計(jì)分析采用SSPS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1培養(yǎng)液中雜細(xì)胞的傳代自流產(chǎn)胎兒海馬區(qū)分離培養(yǎng)的細(xì)胞,在含bFGF、EGF、B27的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2周后呈團(tuán)狀,懸浮生長(zhǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)初期,見(jiàn)一些貼壁的雜細(xì)胞及漂浮的細(xì)胞碎片。經(jīng)傳代后,雜細(xì)胞逐漸減少甚至消失。存活的單個(gè)細(xì)胞經(jīng)分裂各自形成神經(jīng)球,大小不等,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)神經(jīng)球逐漸增大。2.2人神經(jīng)干細(xì)胞貼壁神經(jīng)球經(jīng)Nestin間接免疫熒光染色呈陽(yáng)性。培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞加入24孔培養(yǎng)板后2h即可貼壁。CM-DiI標(biāo)記的hNSCs在熒光顯微鏡下觀察,波長(zhǎng)543nm激發(fā)光下呈紅色熒光。2.3移植后4周的bcb評(píng)分移植組BBB評(píng)分隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,而且移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分均高于對(duì)照組,移植后4周時(shí),移植組BBB評(píng)分顯著高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。移植后8周時(shí),移植組BBB評(píng)分≥15分,而對(duì)照組均≤10分,見(jiàn)表1。2.4hnscs的遷移熒光顯微鏡下,hNSCs移植后4、8周脊髓組織切片可見(jiàn)大量呈紅色熒光的CM-DiI標(biāo)記的hNSCs,移植后4周可見(jiàn)CM-DiI標(biāo)記的hNSCs主要存活于注射部位,少數(shù)向四周遷移,而移植后8周則見(jiàn)大部分細(xì)胞向損傷頭尾兩側(cè)遷移,最遠(yuǎn)可遷移至距注射部位10mm處。移植后4周及8周免疫熒光染色均可見(jiàn)到移植的hNSCs部分表達(dá)GFAP、NeuN、CNPase(圖1C、1F、1J中黃色熒光),且在移植后8周還檢測(cè)到Nestin表達(dá)、仍保持未分化狀態(tài)的移植hNSCs(圖1M中黃色熒光)。3術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)促進(jìn)SCI肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵在于損傷脊髓的再生修復(fù),目前中樞神經(jīng)再生機(jī)制尚未完全揭示。研究表明干細(xì)胞移植是恢復(fù)肢體功能的有效方法之一,干細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷可以促進(jìn)脊髓組織修復(fù),甚至功能恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,hNSCs移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分均高于對(duì)照組,移植后4周時(shí),移植組大鼠后肢BBB評(píng)分顯著高于對(duì)照組,表明移植的hNSCs可促進(jìn)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。而且hNSCs移植治療大鼠脊髓損傷4周時(shí)后肢運(yùn)動(dòng)功能比1周時(shí)有明顯的恢復(fù),推測(cè)這可能與損傷脊髓處神經(jīng)的修復(fù)和再生有關(guān)。免疫熒光結(jié)果證實(shí),hNSCs可在損傷脊髓處長(zhǎng)時(shí)間存活至少達(dá)鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。而且hNSCs移植治療大鼠脊髓損傷4周時(shí)后肢運(yùn)動(dòng)功能比1周時(shí)有明顯的恢復(fù),推測(cè)這可能與損傷脊髓處神經(jīng)的修復(fù)和再生有關(guān)。免疫熒光結(jié)果證實(shí),hNSCs可在損傷脊髓處長(zhǎng)時(shí)間存活至少達(dá)8周,可分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,并向損傷脊髓的頭尾兩端遷移,最遠(yuǎn)可達(dá)10mm。目前,移植細(xì)胞在受損脊髓中存活、聚集和遷移的機(jī)制尚不清楚,分析1周時(shí)起效可能與細(xì)胞開(kāi)始適應(yīng)脊髓微環(huán)境,分化成神經(jīng)細(xì)胞并分泌促進(jìn)神經(jīng)再生的細(xì)胞因子有關(guān),也可能與移植細(xì)胞開(kāi)始向神經(jīng)環(huán)路整合作用有關(guān),4周時(shí)后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)較1周明顯,說(shuō)明植入細(xì)胞能長(zhǎng)期存活并適應(yīng)機(jī)體環(huán)境,繼續(xù)促進(jìn)損傷脊髓的再生修復(fù)。1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雌性SD大鼠24只,體重225±25g,購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。1.1.2hnscs移植DMEM/F12購(gòu)自Hyclone公司;B27、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和N2購(gòu)自Sigma公司;DNaseⅠ購(gòu)自Roche公司;CM-DiI熒光染料購(gòu)自Eugene,OR公司;小鼠抗人Nestin一抗、小鼠抗人NeuN一抗、小鼠抗人GFAP一抗、小鼠抗人CNPase一抗和羊抗小鼠IgG-FITC二抗購(gòu)自abcam公司;正常山羊封閉血清購(gòu)自武漢博士德公司。移植的hNSCs可以在大鼠脊髓損傷處存活、遷移,分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞,并能使脊髓損傷大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能得到部分恢復(fù),其機(jī)制可能與以下因素有關(guān):①hNSCs填充損傷區(qū),補(bǔ)充損傷后缺失的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;②分泌有益于宿主脊髓的多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,改善脊髓局部微環(huán)境,促進(jìn)軸突的功能再生;③提供化學(xué)或物理的引導(dǎo),刺激脊髓神經(jīng)生長(zhǎng),引導(dǎo)損傷神經(jīng)再生