鞘內(nèi)注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)及神經(jīng)細(xì)胞的影響

鞘內(nèi)注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)及神經(jīng)細(xì)胞的影響

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（ngf）是第一個(gè)也是最相關(guān)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。NGF有利于神經(jīng)干細(xì)胞的存活,有促進(jìn)其分化和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元的能力,對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能表達(dá)有調(diào)控作用。神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells,NSCs)的概念提出后,NSCs就以分裂能力強(qiáng)、具有多向分化潛能等特性成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。成年哺乳動(dòng)物脊髓中存在NSCs,為脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞再生提供潛在依據(jù)。內(nèi)源性NSCs有存活率高、無(wú)移植風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn),成為治療脊髓損傷的一個(gè)研究方向。本研究觀察鞘內(nèi)注射NGF對(duì)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)及神經(jīng)細(xì)胞變化的影響。1單次給藥及術(shù)后輔助1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組成年SD大鼠52只,SPF級(jí),體重220～250g,雌雄不拘,由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成鞘內(nèi)注射NGF組(n=20)、肌肉注射NGF組(n=16)和對(duì)照組(鞘內(nèi)注射NS,n=20)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1模型制備及微量給藥裝置的置入將大鼠用10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉,以T10棘突為中心做背后正中切口,長(zhǎng)約3cm,切開皮膚及皮下組織,咬除T10、T11、T12棘突及兩側(cè)椎板,充分顯露硬脊膜,約1cm;以T10對(duì)應(yīng)區(qū)域?yàn)閾p傷區(qū),脊髓后正中為中心,采用改良Allen法以25勢(shì)能克·厘米力(10g×2.5cm)損傷力度制備脊髓損傷模型;于所暴露脊髓尾端旁側(cè)用顯微手術(shù)鑷夾起硬脊膜,縫線針刺孔,見少量腦脊液流出時(shí),將連有套管并充滿相應(yīng)液體(鞘內(nèi)注射NGF組為NGF溶液,對(duì)照組為NS)的微管插入硬脊膜下約7mm,暴露于硬脊膜外的微管牢固固定于周圍軟組織,套管置于皮外,螺帽旋緊套管。肌肉注射NGF組僅進(jìn)行損傷,未刺破硬脊膜,不置入給藥微管。大鼠單籠飼養(yǎng),術(shù)后前4天注射青霉素鈉(20萬(wàn)U/次,2次/d);早晚輔助排尿各一次,直至自主排尿。52只大鼠未見明顯感染,其中3只死亡,2只套管脫落,根據(jù)對(duì)應(yīng)分組分別予以補(bǔ)充。給藥過(guò)程中無(wú)受阻現(xiàn)象。所有大鼠給藥至取材前1天。1.2.2藥物配制將NGF(武漢海特生物制藥股份有限公司提供)完全溶解于240μlNS中,用泵連接給藥系統(tǒng)對(duì)鞘內(nèi)注射NGF組大鼠以1μl/min速度推注18μl(相當(dāng)于NGF1.5μg);肌肉注射NGF組大鼠每日后肢肌肉注射溶解于1.33mlNS中的NGF溶液0.1ml(相當(dāng)于NGF1.5μg);對(duì)照組大鼠相同方法每日鞘內(nèi)推注18μlNS。1.2.3Basso-Beattle-Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分術(shù)后1、7、14、21、28d采用BBB評(píng)分系統(tǒng)檢測(cè)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。評(píng)分采用雙盲法,評(píng)分者為非本實(shí)驗(yàn)掌握評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)人員。1.2.4脊髓組織取材及檢測(cè)分別于術(shù)后7、14、21、28d處死鞘內(nèi)注射NGF組大鼠5只,對(duì)照組和肌肉注射NGF組分別處死大鼠4只。心臟灌注取損傷段脊髓組織(約3mm),固定24h,常規(guī)處理后連續(xù)切片(厚5μm),每個(gè)標(biāo)本組織塊取1張切片進(jìn)行HE染色,光鏡觀察;另取3張切片用免疫熒光染色方法分別檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞(Nestin陽(yáng)性細(xì)胞)、神經(jīng)元(MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性細(xì)胞)。切片脫蠟至水,微波高溫修復(fù),山羊血清封閉,37℃孵育30min,分別滴加兔抗Nestin(1∶50稀釋)、兔抗MAP-2(1∶50稀釋)、兔抗GFAP(1∶100稀釋)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),4℃過(guò)夜,37℃復(fù)溫30min,避光滴加山羊抗兔FITCIgG(H+L)(1∶200稀釋,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),37℃孵育90min,PBS溶液沖洗,抗熒光淬滅封片液封片,免疫熒光鏡觀察。經(jīng)FITC標(biāo)記的二抗染色,Nestin、MAP-2、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞均表現(xiàn)綠色熒光,每張切片隨機(jī)選4個(gè)高倍視野(×400)觀察相應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞分布。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,組間比較采用單因素方差分析。2結(jié)果2.1形態(tài)狀態(tài)下選擇文組后,瓶?jī)?nèi)注射ngf組與對(duì)照組評(píng)分對(duì)比3組大鼠脊髓損傷后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),后肢運(yùn)動(dòng)功能均能得到不同程度的改善。損傷后1、7、14d,鞘內(nèi)注射NGF組與對(duì)照組評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但相同時(shí)間點(diǎn)時(shí),鞘內(nèi)注射NGF組評(píng)分均高于對(duì)照組;損傷后21d和28d,鞘內(nèi)注射NGF組評(píng)分明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在相同時(shí)間點(diǎn)時(shí),鞘內(nèi)注射NGF組運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分均高于肌肉注射NGF組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。2.2劍法損傷的可以改變HE染色結(jié)果顯示:損傷后7、14d,3組大鼠損傷脊髓組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,神經(jīng)纖維排列稀疏、雜亂、斷裂,有瘢痕組織形成,鞘內(nèi)注射NGF組損壞程度較另外兩組略輕;損傷后21d,鞘內(nèi)注射NGF組大鼠損傷的脊髓組織結(jié)構(gòu)較7、14d時(shí)完整,神經(jīng)纖維排列相對(duì)緊密,另外兩組神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)改善不明顯,瘢痕形成較嚴(yán)重;損傷后28d,損傷的脊髓組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步恢復(fù),鞘內(nèi)注射NGF組仍明顯好于另外兩組。2.3組患兒損傷后ddh-1、32d累犯致死時(shí)發(fā)揮半模型檢測(cè)Nestin、MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目見表2、3和圖1、2。損傷后7d,3組大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;損傷后14、21、28d鞘內(nèi)注射NGF組均多于對(duì)照組和肌肉注射NGF組;與對(duì)照組比較,鞘內(nèi)注射NGF組兩者數(shù)目增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組損傷脊髓GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分布均較多,21d時(shí)明顯,鞘內(nèi)注射NGF組比對(duì)照組少,與肌肉注射NGF組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖3。3不同途徑輸注ns后的神經(jīng)再生:內(nèi)源性神經(jīng)損傷和精神傷血脊髓損傷后,損傷部位周圍會(huì)出現(xiàn)一個(gè)神經(jīng)功能損傷區(qū)域,區(qū)域內(nèi)組織壞死和細(xì)胞凋亡,損傷可以啟動(dòng)遲發(fā)的二次損害,同樣導(dǎo)致組織壞死和細(xì)胞凋亡,使神經(jīng)系統(tǒng)遭受破壞。其中神經(jīng)元的丟失、軸突的損傷以及少突膠質(zhì)細(xì)胞的破壞會(huì)導(dǎo)致脊髓傳導(dǎo)功能障礙。過(guò)去認(rèn)為成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)因神經(jīng)元再生能力低、損傷區(qū)域局部微環(huán)境變化及后期瘢痕的形成阻礙了軸突形成,受損幾乎無(wú)法恢復(fù)。研究表明脊髓損傷并非完全不可恢復(fù),脊髓受外傷后可刺激自身一些內(nèi)源性神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞增殖,使功能有限恢復(fù)。本研究中,大鼠脊髓損傷后鞘內(nèi)注射NS,其運(yùn)動(dòng)功能也有所恢復(fù)。Okanoetal認(rèn)為損傷誘導(dǎo)神經(jīng)再生主要通過(guò)3個(gè)步驟:①內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞的活化;②中轉(zhuǎn)放大細(xì)胞和成神經(jīng)元遷移;③新生神經(jīng)元的存活和成熟。研究表明,NSCs移植入體內(nèi)后只有很少量向神經(jīng)元方向分化,不足以修復(fù)損傷脊髓,其主要分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,容易形成瘢痕組織,阻礙神經(jīng)纖維再生。成年哺乳動(dòng)物脊髓中存在NSCs,這一發(fā)現(xiàn)改變了脊髓神經(jīng)細(xì)胞不能再生的觀念。內(nèi)源性NSCs具有促進(jìn)自我修復(fù)和向神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的潛能。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損傷后,可刺激靜息的NSCs增殖、分化,并向損傷部位遷移而修復(fù)損傷的神經(jīng)系統(tǒng)。由內(nèi)源性NSCs增殖來(lái)治療脊髓損傷可避免移植導(dǎo)致的二次損傷和感染率增加等問(wèn)題。NGF可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活、軸突生長(zhǎng),抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示鞘內(nèi)注射NGF能夠使NSCs更多的向神經(jīng)元方向分化,從而更有效地促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。目前NGF主要通過(guò)肌肉注射的方式應(yīng)用于臨床,減少感覺(jué)神經(jīng)元丟失,治療周圍神經(jīng)損傷。鞘內(nèi)注射NGF可以避開血腦屏障的阻礙,提高損傷區(qū)域局部藥