數(shù)字pcr技術(shù)的研究進(jìn)展

數(shù)字pcr技術(shù)的研究進(jìn)展

數(shù)字pcr（數(shù)字pcr，dpcr）是近年來發(fā)展起來的一項突破。1992年Sykes等檢測復(fù)雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因時,利用樣品的有限稀釋,讓每個孔中只獲得單個模板分子,通過計算PCR后的擴(kuò)增信號,以期準(zhǔn)確地確定起始分子的數(shù)量,雖然沒有明確提出“數(shù)字PCR”的概念,但是已經(jīng)建立了數(shù)字PCR基本的實驗流程,并且確定了數(shù)字PCR檢測中一個極其重要的原則——以“終點信號的有或無”作為定量方法。這是數(shù)字PCR的雛形。1999年Vogelstein等在檢測糞便中進(jìn)行癌變組織脫離細(xì)胞的BRAF特異突變型基因時,因受到體細(xì)胞基因的干擾,而碰到檢測靈敏度和檢測分辨率的瓶頸,而采用了在384孔板中對每個反應(yīng)孔的樣品量進(jìn)行極限稀釋并增加反應(yīng)孔數(shù)進(jìn)行檢測的方式,從而提出了數(shù)字式PCR的概念,同時也提出如果采用更多孔板其檢測靈敏度會更高,從而指出了數(shù)字PCR系統(tǒng)的發(fā)展方向。1反應(yīng)單元熒光信號的統(tǒng)計數(shù)字PCR一般包括兩部分內(nèi)容,即PCR擴(kuò)增和熒光信號分析。在PCR擴(kuò)增階段,數(shù)字PCR先將樣品稀釋到單分子水平,再平均分配到幾十至幾萬個單元中進(jìn)行反應(yīng)。與qPCR對每個循環(huán)進(jìn)行實時熒光測定的方法不同,數(shù)字PCR是在擴(kuò)增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集,有熒光信號記為1,無熒光信號記為0,有熒光信號的反應(yīng)單元中至少包含一個拷貝的。理論上,在樣品中目標(biāo)DNA濃度極低的情況下,有熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)目等于目標(biāo)DNA分子的拷貝數(shù)。但是,通常每反應(yīng)單元中可能包含兩個或兩個以上的目標(biāo)分子,就需要使用泊松概率分布函數(shù)(Poissondistribution)進(jìn)行計算,根據(jù)反應(yīng)單元總數(shù)、有熒光信號的單元數(shù)以及樣品的稀釋系數(shù),就可以得到樣本的最初拷貝數(shù)(濃度)。數(shù)字PCR的關(guān)鍵是稀釋模板,通過將一個樣本分成幾十到幾萬份,分配到不同的反應(yīng)單元,每個單元包含0個或一個(至多數(shù)個拷貝)的目標(biāo)分子,在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。(如圖1所示)2泊松反應(yīng)單元的確定數(shù)字PCR采用直接計數(shù)的方法進(jìn)行定量分析,即在PCR擴(kuò)增結(jié)束后有熒光信號的反應(yīng)單元記為1,無熒光信號則記為0,有熒光信號的反應(yīng)單元中至少包含一個拷貝的目標(biāo)分子。理論上,在樣品中目標(biāo)DNA濃度極低的情況下,有熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)目等于目標(biāo)DNA分子的拷貝數(shù)。但是,在通常情況下,數(shù)字PCR的反應(yīng)單元中可能包含兩個或兩個以上的目標(biāo)分子,這時需要采用泊松概率分布公式(Poissondistribution)進(jìn)行計算。上式中λ為每個反應(yīng)單元中所含目標(biāo)DNA分子的平均拷貝數(shù)(濃度),p為在一定的λ條件下,每個反應(yīng)單元中所含k個拷貝目標(biāo)DNA分子的概率。λ由樣品的稀釋倍數(shù)m決定,有λ=cm,其中c為樣品的原始拷貝數(shù)(濃度)。當(dāng)k=0(不含目標(biāo)DNA分子)時,上式可簡化為p=e-λ=e-cm,p可以看作是無熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)與反應(yīng)單元總數(shù)的比值,即其中,n為反應(yīng)單元總數(shù),f為有熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)。上式兩邊取對數(shù)(ln)得到根據(jù)數(shù)字PCR反應(yīng)單元總數(shù)和有熒光信號的單元數(shù)以及樣品的稀釋倍系數(shù),就可以得到樣本的最初拷貝數(shù)(濃度)。因為數(shù)字PCR通過終點檢測計算目標(biāo)序列的拷貝數(shù),所以無需采用內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的絕對定量檢測;此外,由于數(shù)字PCR采用終點檢測,因此也不依賴于Ct值,所以數(shù)字PCR反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響大大降低,對PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力也大大提高,具有很高的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。而且在數(shù)字PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過程(稀釋過程)能夠極大的降低與目標(biāo)序列有競爭性作用的背景序列濃度,因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測稀有突變。3反應(yīng)單元的數(shù)目數(shù)字PCR的靈敏度,除了與檢測器的靈敏度和PCR擴(kuò)增效率等因素有關(guān)外,很大程度上取決于反應(yīng)單元的數(shù)目。反應(yīng)單元的數(shù)目越多,數(shù)字PCR的靈敏度越高,準(zhǔn)確度也越高。根據(jù)反應(yīng)單元形成的不同方式,主要有微反應(yīng)室/孔板、微流控芯片和微滴等三類數(shù)字PCR系統(tǒng)。3.1反應(yīng)單元數(shù)目對檢測的影響早期的數(shù)字PCR技術(shù)采用96/384孔板作為反應(yīng)單元。但是數(shù)字PCR技術(shù)的靈敏度取決于反應(yīng)單元的總數(shù),反應(yīng)單元數(shù)越多越有利于提高靈敏度和準(zhǔn)確度,普通的96/384孔板無法滿足檢測的需要。因此,出現(xiàn)了成倍提高反應(yīng)單元數(shù)目的做法,反應(yīng)體積從微升級降至納升級。但是隨著反應(yīng)單元數(shù)目的增多、反應(yīng)體積的減少,人工操作無法實現(xiàn)快速精準(zhǔn)取樣,就需要借助高通量自動上樣設(shè)備,大幅提高了儀器成本和操作復(fù)雜性。(如圖2所示)3.2組合單元法隨著微流體技術(shù)、納米制造技術(shù)和微電子技術(shù)等的發(fā)展,微流控芯片技術(shù)的使用使數(shù)字PCR能夠快速并準(zhǔn)確地將樣品流體分成若干個獨立的單元,進(jìn)行多步平行反應(yīng),成本低、體積小和高通量,是理想的數(shù)字PCR平臺。目前Fluidigm公司的Bio-MarkTM基因分析系統(tǒng),LifeTechnologies公司的QuantStudioTM3D數(shù)字PCR系統(tǒng)均均為采用微流控芯片技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)。3.3液滴數(shù)字pcrrod液滴數(shù)字PCR源于乳液PCR(emulsionPCR)技術(shù),利用微滴發(fā)生器可以一次生成數(shù)萬乃至數(shù)百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴,作為數(shù)字PCR的樣品分散載體。PCR反應(yīng)結(jié)束后檢測每個微滴的熒光信號。通過油水兩相間隔得到的以液滴為單位的PCR反應(yīng)體系,更容易實現(xiàn)小體積和高通量,而且系統(tǒng)簡單,成本低,因此成為理想的數(shù)字PCR技術(shù)平臺。但是,上述技術(shù)需要將單拷貝DNA模板與磁珠同時包裹在一個液滴中,增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性和定量分析的難度。目前RainDance公司的RainDropTM數(shù)字PCR系統(tǒng),Bio-Rad公司的QX100系統(tǒng)、QX200系統(tǒng)均為采用液滴技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)。(如圖3所示)4dpcr技術(shù)的應(yīng)用前景與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)相比,數(shù)字PCR技術(shù)具有極高的靈敏度、特異性和精確性,使其在臨床診斷、轉(zhuǎn)基因成分定量、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、環(huán)境微生物檢測和新一代測序驗證等研究領(lǐng)域顯示出巨大的優(yōu)勢和應(yīng)用前景,已經(jīng)有大量實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果證明了dPCR技術(shù)的優(yōu)良性能(見表1)。5r的應(yīng)用雖然數(shù)字PCR概念提出至今已經(jīng)有二十多年,但其應(yīng)用仍處于初級階段,截止目前,