aqman實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測登革病毒的比較

aqman實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測登革病毒的比較

鄧革命熱主要出現(xiàn)在熱帶和亞熱帶地區(qū)。這是由鄧革命病毒引起的廣泛分布、發(fā)病多、有害的重要寄生蟲。登革病毒為黃病毒科黃病毒屬的成員,包括4個(gè)血清型(1~4型)。其基因組RNA具有感染性,長約11000bp,編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白及7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1~NS5)。登革熱可以以人為傳染源,因此,準(zhǔn)確、快速的診斷對于及早發(fā)現(xiàn)和管理傳染源,對于控制登革熱的流行具有重要意義。目前,登革熱的病原學(xué)診斷有血清學(xué)方法和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法,前者在診斷的時(shí)效性和敏感性方面均不及后者。但傳統(tǒng)的RT-PCR也存在操作時(shí)間長、容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果等問題。實(shí)時(shí)定量PCR(realtimePCR)方法是一種省時(shí)且敏感性和特異性均較高的技術(shù)方法。為此,我們建立了TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測登革病毒,并與傳統(tǒng)RT-PCR方法進(jìn)行比較?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1材料和方法1.1觀察樣本的制備登革病毒2型NewGuineaC株(DV-2NGC株)由本室保存。使用前取1~3日齡的BALB/c乳鼠(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供),腦內(nèi)接種0.03mL病毒懸液,每天觀察2~3次,連續(xù)觀察2~3周。接種后48h內(nèi)死亡的乳鼠棄去,視為非特異死亡。連續(xù)傳3代,72h后乳鼠開始出現(xiàn)拒乳、抽搐、側(cè)臥、弓背;直至120h,全部乳鼠臨近死亡。無菌操作解剖取腦組織,加入1mLDEPC處理過的三蒸餾水用無菌玻璃研磨器充分研磨,3000r/min離心15min,上清液即為待檢測標(biāo)本,-70℃保存。作為對照的乙型腦炎病毒株(本室保存)同上法處理,已滅活的西尼羅病毒由我校生物技術(shù)學(xué)院黎誠耀教授惠贈(zèng)。1.2病毒rna的提取采用QIAGEN公司的QIAampViralRNAMiniKit核酸提取試劑盒,按試劑盒說明書提取病毒RNA。取140!L檢測標(biāo)本液與bufferAVL-carrierRNA充分混合,吸附至硅膠上。然后分別用bufferAW1、AW2將雜質(zhì)及多余的裂解液從硅膠上洗脫,最后用40!LbufferAVE洗脫硅膠上的病毒RNA,置-70℃保存?zhèn)溆谩?.3基因片段聚合酶鏈反應(yīng)taacctort常規(guī)RT-PCR引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)報(bào)道,針對NS1基因區(qū)域設(shè)計(jì)1對通用引物,所用的引物序列為,forwardprimer:5′-GTGCACACATGGACAGAACA-3′,reverseprimer:5′-CTTTCTATCCAATAACCCAT-3′,擴(kuò)增目的基因片段長度為539bp,由上海生工合成。TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR所用的引物和探針序列為,DENQ-F(NC):5′-AAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCC-3′;DENQ-R(NC):5′-CGTTCTGTGCCTGGAATGATG-3′。ProbeTaqMan,DEN-P:5′-(Hex)TCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT(BHQ-2)-3′(由黎誠耀教授設(shè)計(jì)),交由大連TAKARA公司合成。1.5熒光探針pcr反應(yīng)TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR第一步(RT):總RNA8!L,randomhexamers1!L,10mmol/LdNTPmix1!L。65℃5min,然后冰浴至少1min。每管加入10×RTbuffer2!L,25mmol/LMgCl24!L,0.1MDTT2!L,RNaseOUT(40U/!L)1!L,SuperScriptⅢ(200U/!L)1!L。25℃10min,然后50℃50min,85℃5min停止反應(yīng),立刻冰上放置至少5min,最后每管加入1!LRNaseH,37℃20min即得到cDNA。第二步(PCR):PCR試劑采用TaKaRa公司的PemixExTaqPerfectRealTime。25!L反應(yīng)體系配制如下:2×PremixExTaq12.5!L,ForwardPrimer(10Um)0.5!L,ReversePrimer(10Um)0.5!L,熒光探針溶液1.0!L,50×ROXReferenceDyeⅡ0.5!L,DNA模板5.0!L,ddH2O5.0!L,反應(yīng)條件:95℃10s,95℃5s,60℃20s。共40個(gè)循環(huán)。檢測儀器為Stratagene公司的Mx3000P。標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號達(dá)到熒光閾值時(shí)所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值(Ct值),以Ct值<35判斷為實(shí)時(shí)定量PCR陽性。1.6檢測兩種方法的特異性TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR與普通RT-PCR方法同時(shí)對登革病毒、乙型腦炎病毒和西尼羅病毒進(jìn)行檢測,判斷兩種方法檢測登革病毒的特異性。1.7實(shí)時(shí)定量rt-pcr方法檢測將檢測標(biāo)本在C6/36細(xì)胞培養(yǎng)上標(biāo)定TCID50,標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行10倍梯度稀釋,然后提取RNA,分別采用RT-PCR方法與TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測。2結(jié)果2.1陰性病毒檢測結(jié)果對登革病毒、乙型腦炎病毒及西尼羅病毒分別提取RNA,TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測2次,登革病毒出現(xiàn)陽性結(jié)果,其他兩種病毒的檢測結(jié)果則均為陰性;對登革病毒2型NewGuineaC株,采用C6/36細(xì)胞進(jìn)行病毒效價(jià)滴定(105.6TCID50/mL),然后稀釋成100、10、1、0.1、0.01、0.001TCID50/mL,提取病毒RNA,用TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR進(jìn)行檢測,其中TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR敏感性達(dá)到了0.001TCID50/mL(Ct值為34.91)。2.2taqman實(shí)時(shí)定量rt-pcr兩種方法對登革病毒特異性均理想,對乙型腦炎病毒和西尼羅病毒的檢測均呈陰性。常規(guī)RT-PCR敏感性為0.1TCID50/mL,而TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR比其高出100倍。RT-PCR約費(fèi)時(shí)5~6h,TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR約費(fèi)時(shí)3h,后者比前者至少節(jié)約了2h左右。兩種檢測方法結(jié)果分別見圖1、2。3實(shí)時(shí)定量rt-pcr的基本方法RT-PCR方法應(yīng)用于登革病毒實(shí)驗(yàn)室診斷,國內(nèi)外已有許多報(bào)道,主要有常規(guī)RT-PCR、巢式RT-PCR、多重RT-PCR等,相對以往采用的血清學(xué)和細(xì)胞病毒分離方法,它具有敏感性高、特異性好和快速等優(yōu)點(diǎn)。在傳統(tǒng)的PCR中,常用凝膠電泳分離并用染料染色來檢測PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物,費(fèi)時(shí)、實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣,而且整個(gè)操作環(huán)境要求嚴(yán)格分區(qū),容易造成外界環(huán)境對實(shí)驗(yàn)的污染,導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)等。實(shí)時(shí)定量RT-PCR是基于普通RT-PCR發(fā)展起來的,根據(jù)其化學(xué)原理分為非探針類和探針類兩種,非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加,常用的熒光染料有SYBRGreen;探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加,后者由于增加了特異性探針的識別步驟,特異性更高。本實(shí)驗(yàn)采用特異性更高的探針類(TaqMan)實(shí)時(shí)定量RT-PCR,通過在PCR反應(yīng)體系中加入針對引物的特異性TaqMan熒光探針進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測,不僅提高了檢測敏感性與特異性,而且由于在封閉管中進(jìn)行,省略了電泳這一步驟,大大減少了以往PCR技術(shù)導(dǎo)致假陽性的可能。本研究結(jié)果表明,TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR和常規(guī)RT-PCR兩種方法均具有較高的特異性;在敏感性方面,常規(guī)RT-PCR的敏感性為0.1TCID50/mL,而TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR的敏感性達(dá)到了0.001TCID50/mL,至少節(jié)約了2h,且由于檢測在密封環(huán)境中進(jìn)行,更是大大降低了被外界污染的可能性。不足之處是實(shí)時(shí)定量RT-PCR的費(fèi)用相對高一些,但如果檢測的樣本量較大,也可大大節(jié)約成本,因此我們認(rèn)為TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR用于登革熱的監(jiān)測是可行的,特別是適用于發(fā)生登革熱疫情時(shí)的快速診斷。1.4反應(yīng)型聚合酶鏈反應(yīng)pcr逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)采用20!L體系,體系組分如下:5×逆轉(zhuǎn)錄buffer4.0!L,10mmol/LdNTPs2.0!L,RandomPrimer2.0!L,RNaseinhibitor0.5!L,M-MLV1.0!L,RNA模板10.5!L。反應(yīng)條件為:42℃水浴60min,95℃滅活5min,冰水浴5min。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)采用50!L體系,體系組分如下:10×PCRbuffer5.0!L,10mmol/LdNTPs