耳鮑精子發(fā)生的細(xì)胞學(xué)研究

耳鮑精子發(fā)生的細(xì)胞學(xué)研究

精子發(fā)生是發(fā)育生物學(xué)研究的重要組成部分之一。對(duì)軟體動(dòng)物尤其是重要經(jīng)濟(jì)類型的軟體動(dòng)物的精子發(fā)生的研究，不僅可以加深對(duì)發(fā)育生物學(xué)的理解，豐富發(fā)育生物學(xué)的內(nèi)容，而且可以為發(fā)展提供一些理論基礎(chǔ)，對(duì)預(yù)防和繁殖以及人類疾病方面發(fā)揮重要作用。目前,國內(nèi)外對(duì)腹足類軟體動(dòng)物精子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)研究較多(柯才煥等,1992;鄭曙明等,2000;應(yīng)雪萍等,2002;嚴(yán)云志等,2004;GarreaudeLoubresse,1971;Buckland-Nicksetal,1976;Franzen,1979;Eckelbargaretal,1981;Parivar,1981),對(duì)鮑科動(dòng)物精子發(fā)生的研究僅見于日本鮑(Shiroya,1984),耳鮑精子發(fā)生的研究未見報(bào)道。耳鮑(Haliotisasinisna)隸屬于軟體動(dòng)物門(Mullusca)、腹足綱(Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaegastropoda)、鮑科(Haliotidae),是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值高的貝類,與九孔鮑和雜色鮑相比,耳鮑具有生長速度快,死亡率低的優(yōu)點(diǎn),是很好的全人工繁殖推廣品種。對(duì)耳鮑精子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,不僅可以了解耳鮑生殖生物學(xué)的相關(guān)知識(shí),而且對(duì)耳鮑人工繁殖具有重要的指導(dǎo)作用。1超聲切片機(jī)切片實(shí)驗(yàn)用耳鮑樣采自海南島海域,活體解剖,快速取出精巢,切成小塊,用2.5%戊二醛和1%鋨酸雙固定,梯度酒精脫水,Epon812滲透包埋,LKB-Nova超薄切片機(jī)切片,醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色,Joel-1010型透射電鏡下觀察、拍照。2結(jié)果2.1小鼠精子的分離純化精原細(xì)胞(spermatogonium)緊靠精巢生殖小管基膜,細(xì)胞呈近橢圓形,大小為6.0μm×3.9μm,胞質(zhì)中線粒體少,高爾基體不發(fā)達(dá);細(xì)胞核較大,大小為4.1μm×3.4μm,核質(zhì)較分散,核中異染色質(zhì)少且分布較均勻,核膜清晰(圖1a)。a.精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞,×4000;b.初級(jí)精母細(xì)胞,×8000;c.次級(jí)精母細(xì)胞,×6000;d.精細(xì)胞,×12000;e.分化早期的精細(xì)胞(箭頭示核周腔),×15000;f.分化早期的精細(xì)胞,×15000;g.分化中期的精細(xì)胞,×15000;h.分化中期的精細(xì)胞,×20000;i.分化后期的精細(xì)胞,×15000;j.分化后期的精細(xì)胞,×20000;k.分化后期的精細(xì)胞(箭頭示染色質(zhì)缺失),×15000;l.分化后期的線粒體和鞭毛,×40000;m.成熟精子(箭頭示染色質(zhì)缺失),×15000;n.成熟精子,×30000。圖中字母分別表示:精原細(xì)胞(Sg),初級(jí)精母細(xì)胞(PS),細(xì)胞核(N),線粒體(M),高爾基復(fù)合體(GC),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER),核糖體(R),溶酶體(L),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡(EV),前頂體顆粒(PAG),中心粒(C),前頂體(PA),頂體(A),頂體泡(AV),頂體下腔(S),鞭毛(F),尾部(E),近端中心粒(PC),遠(yuǎn)端中心粒(DC),質(zhì)膜(PM),雙聯(lián)體微管(DM)和中心微管(CM)2.2游離核型半織構(gòu)細(xì)胞的基因型檢測(cè)初級(jí)精母細(xì)胞(primaryspermatocyte)的細(xì)胞胞體稍有增大,細(xì)胞呈近橢圓形,大小為7.0μm×4.9μm。細(xì)胞核大小約為5.6μm×4.0μm,偏向細(xì)胞一極,核內(nèi)染色質(zhì)多數(shù)凝聚成小團(tuán)塊狀散布于其中,核膜清晰(圖1b)。胞質(zhì)中游離核糖體豐富;線粒體數(shù)目增多,分布在細(xì)胞的一側(cè),并逐漸向細(xì)胞核后方聚積(圖1a、b);胞質(zhì)出現(xiàn)高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體,溶酶體的直徑約為0.35μm,內(nèi)容物較均一(圖1b)。2.3dspermatocyte初級(jí)精母細(xì)胞進(jìn)行第一次成熟分裂后產(chǎn)生染色體減半的次級(jí)精母細(xì)胞(secondspermatocyte)。次級(jí)精母細(xì)胞比初級(jí)精母細(xì)胞小,細(xì)胞大小約為6.0μm×3.6μm,核大小約為4.3μm×3.0μm。胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量多,部分線粒體發(fā)生融合而呈扁囊狀,部分線粒體仍呈初始的橢囊狀(圖1c)。2.4頂體顆粒及核型構(gòu)化精細(xì)胞(spermatid)是由次級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂Ⅱ產(chǎn)生的,近圓形,大小約為3.9μm×3.4μm。核圓形或卵圓形,相對(duì)精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞而言最小,約為3.0μm×2.5μm,染色質(zhì)絲狀,較均勻地彌散分布。細(xì)胞中線粒體少,呈短棒狀,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡增多,游離核糖體顆粒增加(圖1d)。精細(xì)胞逐漸分化成熟形成精子,其過程較復(fù)雜,可劃分成三個(gè)階段。分化早期:精細(xì)胞形狀變得不規(guī)則。細(xì)胞核為圓形,部分核膜囊泡化,擴(kuò)張成明顯的核周腔,核內(nèi)染色質(zhì)由較均勻彌散狀分布逐漸聚合成致密的團(tuán)塊狀,相互連接,多數(shù)染色質(zhì)貼附于細(xì)胞核膜內(nèi)面,其余分布于核的中央,核內(nèi)有許多空泡狀的電子密度疏松的區(qū)域。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡形狀變得不規(guī)則,胞質(zhì)內(nèi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡產(chǎn)生的致密圓形顆粒,即為前頂體顆粒(圖1e)。中心粒出現(xiàn),逐漸移向核后端;線粒體分布于細(xì)胞核一端;溶酶體較豐富(圖1f)。分化中期:細(xì)胞形狀變得不規(guī)則。細(xì)胞核呈近圓形,核周腔不明顯,核內(nèi)染色質(zhì)繼續(xù)凝聚成較大的團(tuán)塊,電子密度疏松的區(qū)域向核中央?yún)R集,其內(nèi)出現(xiàn)了顆粒狀、纖維狀物質(zhì)。線粒體移至核的一端,開始融合,隨著精細(xì)胞的分化,線粒體進(jìn)一步融合,形成數(shù)量少、體積大的線粒體集合體(圖1g、h)。前頂體顆粒聚集形成形狀較為規(guī)則、圓形、外膜明顯、內(nèi)充滿均勻的高電子密度物質(zhì)前頂體。胞質(zhì)中高爾基囊泡位于前頂體附近,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡豐富(圖1g、h)。分化后期:細(xì)胞形狀不規(guī)則,胞質(zhì)明顯減少;細(xì)胞核仍為近圓形,與線粒體集合體相對(duì)的一端的核向內(nèi)微凹;前頂體移至核的微凹處,與核結(jié)合,并逐漸空泡化,近細(xì)胞核的一端形成空泡,遠(yuǎn)細(xì)胞核的一端仍充滿均勻的高電子密度物質(zhì)(圖1i)。隨著精細(xì)胞的進(jìn)一步分化,細(xì)胞核由近圓形變成長桶狀,靠近前頂體基部的核進(jìn)一步內(nèi)凹陷形成核內(nèi)凹陷,中間略為突出,后端粗大并在后緣形成核后窩。核內(nèi)染色質(zhì)完全凝聚,趨向于均質(zhì)化,核內(nèi)疏松區(qū)域不斷減少和變小,最后呈空泡狀位于核內(nèi)或核邊緣,成為染色體缺失部位(圖1j),核周腔消失;前頂體進(jìn)一步分化,呈馬蹄形扣在核端(圖1j),并向內(nèi)凹陷,逐漸形成圓錐形的頂體,此凹陷稱為頂體凹陷;核與頂體之間的腔隙,稱為頂體下腔,頂體腔內(nèi)充滿低電子密度物質(zhì)(圖1k);5個(gè)線粒體包圍中心粒;鞭毛已形成,由被原生質(zhì)膜包被的軸絲微管組成,軸絲為典型的“9+2”結(jié)構(gòu)(圖1l);精細(xì)胞中多余的細(xì)胞質(zhì)被拋棄,此時(shí)精細(xì)胞已分化為精子(圖1k)。精細(xì)胞經(jīng)過三個(gè)階段的分化,最終發(fā)育成精子,其中頂體、頂體腔和核構(gòu)成精子的頭部,線粒體和其包圍的中心粒組成精子的中段,鞭毛組成精子的尾部。精細(xì)胞分化的三個(gè)階段是連續(xù)的過程:分化早期,核周腔明顯,核內(nèi)染色質(zhì)聚合成團(tuán)塊,線粒體極化,前頂體顆粒和中心粒出現(xiàn);分化中期,核周腔不明顯,核內(nèi)染色質(zhì)進(jìn)一步凝聚,線粒體融合,前頂體顆粒形成前頂體,中心粒被線粒體包圍,軸絲伸展;分化后期,細(xì)胞核由近圓形變成長桶狀,核周腔消失,核內(nèi)染色質(zhì)凝聚并均質(zhì)化,前頂體泡化并發(fā)育成頂體,鞭毛形成,精細(xì)胞分化成精子。2.5頂體及核內(nèi)電子密度耳鮑精子為鞭毛型精子,可分為頭部、中段和尾部(鞭毛)三部分(圖1m、n)。精子頭部由頂體、頂體下腔和細(xì)胞核組成,頂體呈圓錐形,頂端較鈍,外包被一連續(xù)的頂體膜,頂體的電子密度比較均勻;頂體下腔中含有中等電子密度物質(zhì);細(xì)胞核圓棒狀,核內(nèi)電子密度比較均勻。精子中段較短,主要由5個(gè)線粒體包圍一對(duì)中心粒構(gòu)成。尾部是由一根鞭毛組成,從前到后逐漸變細(xì),鞭毛是由原生質(zhì)膜包被的軸絲組成,軸絲為典型的“9+2”微管結(jié)構(gòu)(圖1n)。3討論耳鮑精子發(fā)生過程中,細(xì)胞經(jīng)歷了一系列的變化,主要包括頂體的形成、細(xì)胞核和線粒體的變化和鞭毛的形成。3.1精細(xì)胞分化的分期關(guān)于精細(xì)胞分化過程的分期,不同學(xué)者根據(jù)所觀察的結(jié)果有各自不同的分期方法,有主要根據(jù)頂體的演變特點(diǎn)將精細(xì)胞分化過程分為早、中、后三期(Azevedo,1981),也有根據(jù)頂體的演化、核及染色質(zhì)的變化、線粒體的變化等特點(diǎn)綜合考慮將精細(xì)胞分化過程分為5期(Jaramilloetal,1986),還有在5期的基礎(chǔ)上根據(jù)觀察結(jié)果將精細(xì)胞分化過程分為6期(柯才煥等,1992;嚴(yán)云志等,2004)。作者主要根據(jù)精子頂體演化的特點(diǎn),根據(jù)觀察結(jié)果將耳鮑精細(xì)胞分化過程分為前、中、后三期,其主要依據(jù)分別是前頂體顆粒的出現(xiàn)(前期)、前頂體的形成(中期)、頂體的形成(后期)。3.2腹足類精子的頂體大多數(shù)腹足類軟體動(dòng)物精子具有頂體(柯才煥等,1992;鄭曙明等,2000;應(yīng)雪萍等,2002;GarreaudeLoubresse,1971;Buckland-Nicksetal,1976;Eckelbargaretal,1981),也有些腹足類軟體動(dòng)物精子沒有頂體的形成(嚴(yán)云志等,2004;Franzen,1979;Parivar,1981),耳鮑精子具有頂體。腹足類精子的頂體多來源于高爾基體,精細(xì)胞早期,由高爾基體分泌一個(gè)體積較大的前頂體囊泡和一些體積較小的泡狀體共同組成頂體復(fù)合體。也有些腹足類精子的頂體不是來自于高爾基體,而形成于細(xì)胞質(zhì)中的大量前頂體顆粒。在耳鮑精子發(fā)生過程各時(shí)期中,高爾基體發(fā)現(xiàn)較少,在精細(xì)胞期也未觀察到前頂體囊泡和大量泡狀體的產(chǎn)生,但在細(xì)胞質(zhì)中觀察到前頂體顆粒物質(zhì)的產(chǎn)生,因此,作者認(rèn)為耳鮑精子頂體的形成不是來自高爾基體,而可能形成于胞質(zhì)中的前頂體顆粒,這與日本鮑精子頂體的形成相同(Shiroya,1984)。耳鮑精子發(fā)生過程中,在精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母中沒有觀察到前頂體顆粒,但在次級(jí)精母中觀察到了大量的高爾基體,在精子細(xì)胞分化早期觀察了前頂體顆粒,由此可以推斷,耳鮑精子前頂體顆?？赡墚a(chǎn)生于次級(jí)精母和精子細(xì)胞分化早期。3.3精細(xì)胞分化耳鮑精子發(fā)生過程中發(fā)生了染色質(zhì)的濃縮和核的形態(tài)變化,兩者是同時(shí)進(jìn)行的。精細(xì)胞在分化過程中,核由近圓形變成與細(xì)胞長軸一致的長桶狀,并出現(xiàn)明顯的核內(nèi)凹陷;染色質(zhì)濃縮,細(xì)胞核成為電子密度較大的勻質(zhì)物質(zhì),使核體積縮小,便于精子運(yùn)動(dòng),有利于精子快速穿過卵膜,提高耳鮑的受精率。3.4精細(xì)胞內(nèi)部生成能量線粒體的形態(tài)、大小、數(shù)量與分布,在不同的細(xì)胞內(nèi)變動(dòng)很大,同一細(xì)胞在不同生理狀態(tài)下也不一樣(翟中和等,2000)。在耳鮑精子發(fā)生過程中,線粒體經(jīng)歷了由少到多,由小到大的積累過程。精原細(xì)胞線粒