豬胰蛋白酶的分離純化與鑒定

精品資料精品資料豬胰蛋白酶的分離純化與鑒定、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握等電點(diǎn)沉淀、鹽析及離子交換層析原理及操作。2、熟悉胰蛋白酶分離純化的一般過程。3、掌握胰蛋白酶活力測(cè)定方法及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理胰蛋白酶是以無活性的酶原形式存在于動(dòng)物胰臟中，在Ca2+的存在下，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，從肽鏈N端賴氨酸和異亮氨酸殘基之間的肽鍵斷開，失去一段六肽，分子構(gòu)象發(fā)生一定改變后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌?。豬胰蛋白酶的分子量約為23400,其等電點(diǎn)約為pH10.8,最適pH7.6?8.0,胰蛋白酶在pH3條件下較穩(wěn)定，在pH5以上易自溶，Ca2+離子對(duì)胰蛋白酶有穩(wěn)定作用,在低溫條件下貯存數(shù)周內(nèi)酶的活性不發(fā)生明顯的改變。本實(shí)驗(yàn)以豬胰臟為材料，首先用酸性水溶液抽提組織，在 Ca2+離子存在條件下，以少量胰蛋白酶結(jié)晶激活所得的酶原，再以硫酸銨鹽析獲得粗胰蛋白酶。經(jīng)過透析除鹽，以羧甲基纖維素柱陽離子交換層析進(jìn)行純化，即可獲得較純的胰蛋白酶。胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對(duì)于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn)為對(duì)堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶對(duì)這些鍵的敏感性次序?yàn)椋乎ユI>酰胺鍵>肽鍵。因此可利用含有這些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物來測(cè)定胰蛋白酶的活力。本實(shí)驗(yàn)以酪蛋白為底物的方法來測(cè)定胰蛋白酶活力，其主要用于測(cè)定胰蛋白酶粗制品的活力。胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯乙酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定濃度范圍內(nèi)酶的水解濾液在波長280nm處光吸收的增值與胰蛋白酶的活力單位成正比。測(cè)定中以標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液的光吸收值做對(duì)照，根據(jù)酶活力蛋白的定義，確定樣品中胰蛋白酶的活性?；盍挝坏亩x：在一定條件下每分鐘酶水解濾液光吸收的增值與1m酪氨酸在280nm處光吸收值相同時(shí)的酶量為一個(gè)蛋白酶活力單位（U）。三、試劑和器材1、試劑：（1）pH2.5乙酸酸化水：在酸度計(jì)監(jiān)測(cè)下，向蒸餾水中加入乙酸，使pH達(dá)2.5。（2） 10%（V/V）HAc溶液（3） 2.5mol/LH2SO4（4） 5mol/LNaOH（5） 2mol/LHCl（6） 0.001mol/LHCl（7） 0.01mol/L,pH5.0，檸檬酸鈉緩沖液：量取41mL0.01mol/L檸檬酸溶液（2.10gH3C6H5O7H2O/L）,加入59mL0.01mol/L檸檬酸鈉溶液（2.9gNa3C6H5O72H2O/L）混勻，用酸度計(jì)檢查pH值是否為5.0。（8） 0.05mol/L,pH5.0，檸檬酸鈉緩沖液：量取8.2mL0.05mol/L檸檬酸溶液（10.5gH3C6H5O7H2O/L）,加入11.8mL0.05mol/L檸檬酸鈉溶液（14.705gNa3C6H5O72H2O/L）混勻，用酸度計(jì)檢查pH值是否為5.0。（9） 0.1mol/L,pH6.0，檸檬酸鈉緩沖液：10)11)10)11)12)12)量取19mLO.1mol/L檸檬酸溶液(21gH3C6H5O7H2O/L),加入81mLO.1mol/L檸檬酸鈉溶液(29gNa3C6H5O72H2O/L)混勻，用酸度計(jì)檢查pH值是否為6.O。8％三氯乙酸10mg/mL酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，力卩13mL0.5mol/LNaOH溶液,0.1MTris—HCl緩沖液，pH8.040mL，置85C水浴加熱至溶解，放至室溫后，加上述緩沖液40mL,用1NHCl小心調(diào)pH為8.0，用緩沖液定容至100mL。不同pH值緩沖液的的配制I0.1M磷酸緩沖液：pH6.0、6.5、7.0、7.5a.0.1M磷酸氫二鈉的配制:稱取Na2HPO412H2O(358.14g/mol)17.9070gb.加水定容至500mL0.1M磷酸二氫鈉的配制:7.8005g稱取NaH2PO42H2O(156.01g/mol)7.8005g500mL加水定容至500mLc.二者互兌至相應(yīng)pH值n0.1MTris—HCl緩沖液：pH8.0、8.5、9.0稱取Tris12.11g加入水60mL用3NHCl調(diào)至所需pH加水定容至100mLm0.1MNaCO3-NaHCO3緩沖液：pH9.5、10.0、10.5a.0.1MNaCO3的配制:稱取NaCO35.2995g加水定容至500mLb.0.1MNaHCO3的配制:稱取NaHCO34.2005g定容至500mLc.二者互兌至相應(yīng)pH值13）SDS（聚丙烯酰胺凝膠電泳）所需試劑（無需配制）30%儲(chǔ)備膠溶液：將29.0g丙烯酰胺（Acr）和1.0gN-N亞甲雙丙烯酰胺（Bis）溶于60mL水中，于37C溶解，定容至100mL,棕色瓶存于室溫。1.5mol/LTris—HCl（pH8.8）:Tris18.17g力卩ddH20溶解，濃鹽酸調(diào)pH至8.8，定容至100mL。1.0mol/LTris—HCl（pH6.8）:Tris12.11g力卩ddH2O溶解，濃鹽酸調(diào)pH至6.8，定容至100mL。10%SDS:電泳級(jí)SDS10.0g力卩ddH2O68C助溶，濃鹽酸調(diào)至pH7.2，定容至100mL。10%過硫酸銨（AP）： 100mgAP加ddH2O至1mL。TEMED采用原包裝液，4C保存。10＞電泳緩沖液（pH8.3）:Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10mL力卩ddH20溶解,定容至100mL。4XSDS電泳上樣緩沖液：200mmol/LTris-HCI(pH6.8),8%SDS,0.4%溴酚蘭1.0ml,40%甘油考馬斯亮藍(lán)染色液：考馬斯亮藍(lán)(R-250) 0.25g,甲醇225mL,冰醋酸46mL,ddH2O225mL。脫色液：甲醇、冰醋酸、ddH2O以3:1:6配制而成。2、 材料新鮮或冰凍豬胰臟3、 儀器組織搗碎機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、磁力攪拌器、透析袋、分析天平、蛋白質(zhì)柱層析系統(tǒng)、恒溫水浴鍋、電泳儀、電泳槽、計(jì)時(shí)器、 pH計(jì)、凝膠成像儀、核酸蛋白質(zhì)分析儀。四、實(shí)驗(yàn)方法?豬胰蛋白酶的分離純化(1)粗豬胰蛋白酶的提取取豬胰臟，除去脂肪和結(jié)締組織，切碎，稱重約 50g加入5倍體積預(yù)冷的pH2.5乙酸酸化水用組織搗碎機(jī)搗碎離心10000rpm,15min用4層紗布過濾得上清液（收集約1.5mL,作為留樣1，測(cè)蛋白含量，及時(shí)SDS化）將研細(xì)的固體無水氯化鈣慢慢加入酶原溶液中，邊加邊攪拌均勻，使溶液中最終含有0.1mol/LCaCI2加入極少量豬胰蛋白酶（約2-5mg），輕輕攪拌均勻用5mol/LNaOH調(diào)pH為8.0于25C下活化4~6小時(shí)（2小時(shí)取樣一次），測(cè)定酶活性增加的情況活化完成后，用2.5mol/LH2SO4調(diào)pH至2.5?3.0（收集約1.5mL,作為留樣$測(cè)蛋白含量，及時(shí)SDS化）量取體積，加入固體硫酸銨達(dá)到75%飽和度，靜置過夜1000010000rpm，15min沉淀為粗胰蛋白酶（2）透析將粗胰蛋白酶溶于適量預(yù)冷的0.001mol/LHCI溶液中，用2mol/LHCI調(diào)pH至3，在4C下對(duì)0.001mol/LHCl溶液透析10小時(shí)，而后改用0.01mol/L,pH5.0檸檬酸鈉緩沖液透析過夜。次日，離心10000rpm,15min，取上清(記錄樣品體積,收集約1.5mL,作為留樣3,測(cè)蛋白含量，及時(shí)SDS化)(2)離子交換層析法初步純化豬胰蛋白酶用0.01mol/L,pH5.0檸檬酸鈉緩沖液平衡CM-纖維素離子交換柱直接上樣于CM-纖維素離子交換柱以0.01mol/L,pH5.0檸檬酸鈉緩沖液充分洗凈未吸附蛋白質(zhì)I用0.05mol/L,pH5.0，檸檬酸鈉緩沖液洗脫，并收集，此峰為豬胰凝乳蛋白酶I待胰凝乳蛋白酶峰過后，改用0.1mol/L,pH6.0，檸檬酸鈉緩沖液洗脫，此時(shí)出現(xiàn)一洗脫峰，收集洗脫液為豬胰蛋白酶。再生柱子(0.5MNaOH-0.5MNaOH)I用蒸餾水洗至呈中性?蛋白質(zhì)含量的測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用紫外吸收法。用核酸蛋白分析儀分別測(cè)定蛋白質(zhì)樣品在280nm、260nm處的吸收值，以緩沖液為空白對(duì)照，按下式計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度C（mg/mL）:蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度=n（1.45A28。-0.74A26。）式中，A280:蛋白質(zhì)溶液在280nm測(cè)得的吸收光度；A260:蛋白質(zhì)溶液在260nm測(cè)得的吸收光度；n：稀釋倍數(shù)。?酶活力的測(cè)定①取3支試管按1?3編號(hào)。NO.1體系：樣品管TOC\o"1-5"\h\z酶液 1mL（用0.1MTris-HCI、pH8.0緩沖液稀釋至合適的濃度，酶液與緩沖液的量為1mL,可根據(jù)具體情況來調(diào)節(jié)酶液的濃度，一般粗胰蛋白酶為10?80購/mL，純化胰蛋白酶約為6?20?/mL）精確加入37T預(yù)熱的10mg/mL酪蛋白溶液 1mL混勻，立即置于37°C水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)10min加入8%三氯乙酸 3mL迅速搖勻，終止反應(yīng)3000r/min,5min取上清，測(cè)A280NO.2體系：對(duì)照管TOC\o"1-5"\h\z37T預(yù)熱的10mg/mL酪蛋白溶液 1mL8%三氯乙酸 3mL搖勻加入酶液（與體系1濃度相同） 1mL37C,10min取出，終止反應(yīng)3000r/min,10min取上清，測(cè)A280NO.3體系:空白管分別加入3mL8%三氯乙酸和2mL0.1MTris-HCI、pH

8.0緩沖液，3000r/min,5min 離心，取上清，測(cè)A280②胰蛋白酶活力的計(jì)算△A280胰蛋白酶活力單位數(shù) t比活力=比活力=酶活力單位/毫克蛋白質(zhì)式中從28。 樣品管A280-對(duì)照管A280C 每個(gè)樣品管中酶液的濃度（mg/mL）V 每個(gè)樣品管中酶液體積（mL）t 反應(yīng)時(shí)間（min）.純化效果測(cè)定各階段（粗酶液留樣1，酸沉淀后酶液留樣2,胰蛋白酶原樣品留樣3,胰酶激活后樣品留樣4，離子交換層析后活力較高樣品留樣5）的純化效果用12%的SDS—PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的記錄

提純過程樣品體積（mL）A280A260活性NO.1A280N0.2A280粗提液（留樣1）胰酶激活后（留樣4）透析后上柱前樣品（留樣5）管1略管3管5管72?離子交換層析后收集各管樣品的蛋白含量及活性。管數(shù)蛋白含量（mg/mL）或A280活性(NO.1A280-N0.2A280)1357六、結(jié)果與討論1?離子交換層析后收集各管樣品的蛋白含量及活性。以管數(shù)為橫坐標(biāo)、以A280及活性為縱坐標(biāo)，制作雙坐標(biāo)圖的離子交換層析曲線。（以管數(shù)為橫坐標(biāo)、以蛋白含量及活性為縱坐標(biāo)，制作雙坐標(biāo)圖的離子交換層析曲線）3?測(cè)定粗酶液、胰酶激活后樣品、離子交換層析收集管中樣品液的體積及酶活力,完成純化表格。提取純化步驟總酶活總蛋白量比 活收率純化倍數(shù)(U)(mg)(U/mg)(%)粗酶液胰酶激活后樣品透析后上柱前樣品離子交換層析4.SDS電泳結(jié)果七、 思考題提取制備豬胰蛋白酶的過程中，應(yīng)特別注意哪些主要環(huán)節(jié)和影響因素？胰蛋白酶活力的測(cè)定方法還有哪些？在實(shí)驗(yàn)中，可以采取什么方法來提高產(chǎn)率和比活率？八、 參考文獻(xiàn)1、 馬麗、邱業(yè)先、楊進(jìn)軍等.元寶楓蛋白酶的分離純化及其生化性質(zhì).植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2005,14(1):6—92、 俞建瑛、蔣宇、王善利編?生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)?化學(xué)工業(yè)出版社.20053、陳珊珊、林雄水、翁凌等.草魚胰蛋白酶的分離純化及性質(zhì)研究.集美大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005,10(4):300—304附錄：1.硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表(0°C)硫酸銨終濃度，%飽和度20253035404550556065707580859095100硫每毎100毫升溶液加固體硫酸銨的克數(shù)"①酸010.613.416.419.422.625.829.132.636.139.843.647.651.655.960.365.069.7銨57.910.813.716.619.722.926.229.633.136.840.544.448.452.657.061.566.2初濃度105.38.110.913.916.920.023.326.630.133.737.441.245.249.353.658.162.712.65.48.211.114.117.220.423.727.130.634.338.142.046.050.354.759.2%5飽202.75.58.311.314.317.520.724.127.631.234.938.742.746.951.255.7和0度2502.75.68.411.514.617.921.124.528.031.735.539.543.647.852.2

3002.85.68.611.714.818.121.424.928.532.336.210.244.548.8302.85.78.711.815.118.421.825.429.132.936.941.045.35402.95.88.912.015.318.722.225.829.633.537.641.80402.95.99.012.315.619.022.626.330.234.238.35503.06.09.212.515.919.423.026.330.834.80503.06.19.312.716.119.723.527.331.35603.16.29.512.916.420.123.127.90603.16.39.713.216.820.524.45703.26.59.913.417.120.90703.26.610.113.717.45803.36.710.313.908