g蛋白激活內(nèi)側(cè)流變型鉀通道的研究進(jìn)展

g蛋白激活內(nèi)側(cè)流變型鉀通道的研究進(jìn)展

g蛋白激活的內(nèi)東正教鉀通道（gilk或kir3）是k-k超家族中七個(gè)成員中的代表性家族?，F(xiàn)在已知道Kir家族有五個(gè)成員(GIRK1-5),GIRK是目前已知的唯一直接與Gβγ結(jié)合而被激活的離子通道。最初發(fā)現(xiàn)的GIRK是心臟的毒蕈鹼K+通道(KAch),Ach與毒蕈堿M2受體結(jié)合后,通過(guò)激活對(duì)百日咳毒素(PTX)敏感性G蛋白而激活KAch出現(xiàn)負(fù)性變時(shí)效應(yīng),從而降低心率。后來(lái)發(fā)現(xiàn)GIRK亞單位在腦中廣泛分布,很多神經(jīng)遞質(zhì)如γ-氨基丁酸(GABA)、阿片、多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)等通過(guò)激活PTX敏感性G-蛋白而激活GIRK,GIRK通過(guò)慢突觸后抑制性電流而調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性。1吉克斯的分子基礎(chǔ)1.1牛心臟和dirk3中的同源性四聚體GIRK家族共有五個(gè)成員(GIRK1～GIRK5),GIRK通道為四聚體,一般認(rèn)為正常GIRK通道是GIRK1與GIRK2,GIRK3和GIRK4中的一種形成的異源性四聚體,而GIRK1自身不能形成有功能性的通道。但近來(lái)又有研究證明在牛心臟中存在GIRK4的同源性四聚體;Tanya證明在腦中的一些區(qū)域中確實(shí)存由GIRK2和GIRK3亞基組成的異源性多聚體GIRK通道。因此,也可能存在非GIRK1的同源性或異源性四聚體。1.2氨基酸序列及信號(hào)肽GIRK各亞基的長(zhǎng)度在393和501個(gè)氨基酸之間,如人類的四個(gè)亞基GIRK1至GIRK4的氨基酸數(shù)目分別是:501,423,393,419。哺乳動(dòng)物的GIRK各亞基的氨基酸排列循序都已清楚,每一種GIRK亞基在各物種之間的同源性通常超過(guò)90%。人和大鼠的GIRK1有99%的氨基酸序列是相同的。GIRK各亞基之間氨基酸同源性在60%至80%之間,變化最大的氨基端前40個(gè)氨基酸和360位氨基酸以后的羧基端。所有內(nèi)向整流型K+通道的亞基都有一個(gè)相同的結(jié)構(gòu)模式,其特征是有兩個(gè)跨膜區(qū)域M1,M2和一個(gè)與電壓依賴性K+通道相似的孔形成區(qū)域(P或H5)以及胞漿側(cè)的N-端和C-端。GIRK的結(jié)構(gòu)輪廓主要是根據(jù)其疏水性區(qū)域得出的,以下的研究結(jié)果也支持這種摧測(cè):在N-端缺乏一個(gè)信號(hào)肽;各種KirC-端富有的蛋白激酶A(PKA)磷酸化位點(diǎn),如在GIRK1為193位蘇氨酸和497位絲氨酸;幾種Kir如Kir2.2和Kir2.3的羧基最末端有一致序列ES/Tx/I,人類GIRK2,GIRK3能結(jié)合到含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),如PSD95;以上都是細(xì)胞內(nèi)定位的提示序列。細(xì)胞外定位的提示序列,如N-端糖基化位點(diǎn)是在M1和P連接部分,例如在GIRK1為119位天冬酰胺。1.3rgs蛋白抑制劑當(dāng)激動(dòng)劑與含有7個(gè)α-螺旋的跨膜受體結(jié)合后,受體激動(dòng)G蛋白,GTP與Gα亞基結(jié)合,同時(shí)Gβγ與Gα-GTP解離,Gβγ直接激活GIRK導(dǎo)致通道開放。隨后,具有GTP酶活性的Gα水解GTP,Gβγ再與Gα-GDP結(jié)合導(dǎo)致GIRK的失活。這一系列反應(yīng)被認(rèn)為是許多Gi/Go偶聯(lián)型神經(jīng)遞質(zhì)激活GIRK主要通路,研究發(fā)現(xiàn)與百日咳毒素(PTX)敏感性G蛋白Gi/Go偶聯(lián)的受體似乎都可激活GIRK。GIRK的激活不需要細(xì)胞內(nèi)的第二信使參與,但GIRK受細(xì)胞內(nèi)的ATP、Mg2+、磷酯酰肌醇-4,5-二磷酸、磷酸化及機(jī)械張力的調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)的ATP和Na+也能夠影響GIRK通道的基礎(chǔ)電流。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)RGS蛋白對(duì)正常體內(nèi)GIRK通道的失活起著重要作用。雖然對(duì)GIRK的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和調(diào)節(jié)進(jìn)行了大量研究,但GIRK的詳細(xì)門控機(jī)制及調(diào)節(jié)還不很清楚。2病理組織學(xué)檢測(cè)自GIRK各亞基cDNA被克隆后,應(yīng)用原位雜交對(duì)GIRK各亞單位的mRNA在大鼠和小鼠腦中的分布進(jìn)行了廣泛的研究。研究發(fā)現(xiàn)GIRK1-3各亞基在腦中廣泛分布,如在海馬、新皮層、嗅系統(tǒng)、間腦、小腦中含量都很豐富。GIRK4只分布在少數(shù)腦區(qū),研究發(fā)現(xiàn)GIRK4在小鼠腦區(qū)的分布如下:皮層深部的錐體神經(jīng)元,內(nèi)側(cè)梨狀層的核團(tuán)、腦島皮層的屏狀核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、椎狀束旁核、下丘腦室旁核和腦干的核團(tuán)(下橄欖核、前庭核)。而在大鼠則主要分布于小腦顆粒細(xì)胞層、上丘、外側(cè)隔核、海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元。應(yīng)用免疫組化對(duì)GIRK1和GIRK2在腦中的分布進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)GIRK1和GIRK2在腦中的某些區(qū)域有交叉分布,并且GIRK1和GIRK2在腦中各區(qū)域的分布與GIRK1mRNA和GIRK2mRNA在腦中的分布基本一致。如在大腦皮層、海馬、外側(cè)隔核和小腦均有豐富的GIRK1和GIRK2;但在下丘腦、藍(lán)斑和邁特氏基底核兩者的含量均很低。GIRK通道主要存在于神經(jīng)元的胞體和樹突的突觸后膜上,也存在于軸突的突觸前膜上。研究發(fā)現(xiàn),在大鼠海馬CA1區(qū)域的神經(jīng)元GIRK1主要存在于樹突、樹突棘和胞體。Ken發(fā)現(xiàn)在下丘腦室旁核下丘腦室旁核(PVN)的神經(jīng)元胞體沒(méi)有免疫反應(yīng),而在神經(jīng)纖維末梢的曲張?bào)w有染色,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GIRK1在神經(jīng)纖維末梢終扣處免疫反應(yīng)明顯,而在樹突沒(méi)有免疫反應(yīng)。這種免疫反應(yīng)方式證明在PVN中GIRK1存在于突觸前而不是突觸后?？磥?lái),不同腦區(qū)和不同的神經(jīng)元,GIRK存在的亞細(xì)胞部位也不一樣。3吉克斯特中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理影響3.1irk電流的作用盡管GIRK具有內(nèi)向整流作用,但它們通常的生理作用是在接近靜息膜電位水平上允許K+外流。在靜息電位和引起神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位的膜電位之間這種外向的GIRK電流非常重要,這種超極化的K+電流可降低細(xì)胞的興奮性,在中樞神經(jīng)系統(tǒng),主要是調(diào)節(jié)突觸后神經(jīng)元的興奮性。將GIRK1,GIRK2,GIRK4和5-HT1A受體共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元,在給予5-HT后發(fā)現(xiàn)由于GIRK的激活而使神經(jīng)元興奮的閾值增加了2～3倍,最終抑制神經(jīng)元的放電頻率。目前認(rèn)為GIRK調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性主要是減少神經(jīng)元峰電位的頻率,通過(guò)產(chǎn)生慢抑制性突觸后電位抑制神經(jīng)元的興奮性。GIRK是否參與靜息電位的形成還待進(jìn)一步研究。3.2irk1mrna的神經(jīng)元/傳導(dǎo)束GIRK在腦中可能通過(guò)突觸前抑制調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。研究發(fā)現(xiàn)在下丘腦室旁核(PVN)GIRK1蛋白存在于突觸前而不在突觸后,投射到PVN的神經(jīng)元位于下丘腦、邊緣系統(tǒng)和腦干的幾個(gè)神經(jīng)核團(tuán)(如中縫背核、臂旁核),原位雜交證明GIRK1mRNA存在于這些神經(jīng)元中,并且這些神經(jīng)元中含有DA,NA和NY等神經(jīng)遞質(zhì)。在神經(jīng)元和異源性細(xì)胞中均已證明DA,NA和NY的受體和GIRK通道相偶聯(lián)。因而,GIRK可能通過(guò)這些神經(jīng)遞質(zhì)的受體調(diào)節(jié)PVN中催產(chǎn)素、血管加壓素和其它神經(jīng)肽的釋放。應(yīng)用原位雜交和免疫組化的雙標(biāo)技術(shù)發(fā)現(xiàn)在視上核100%的催產(chǎn)素陽(yáng)性神經(jīng)元有GIRK1-3的mRNA表達(dá),95%的加壓素陽(yáng)性神經(jīng)元有GIRK1-3的mRNA表達(dá)。因此,也有可能是通過(guò)GIRK通道調(diào)節(jié)這兩種神經(jīng)元的催產(chǎn)素和加壓素的釋放。一般認(rèn)為在神經(jīng)纖維末梢通過(guò)抑制電壓依賴性鈣通道(VDCC)可抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)GABA和NE都能抑制VDCC而激活GIRK,因而GIRK在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放作用值得深入研究。4dirk通道weaver小鼠是一種遺傳性神經(jīng)生理功能紊亂的小鼠,它有許多缺陷:共濟(jì)失調(diào)、運(yùn)動(dòng)過(guò)多、震顫、癲癇發(fā)作及雄性不育,其病理特征是小腦顆粒細(xì)胞和黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性。有研究發(fā)現(xiàn)造成這些癥狀的原因是GIRK2基因(位于16號(hào)染色體)的一個(gè)堿基發(fā)生了點(diǎn)突變(Gly→Ser),并且突變發(fā)生在K+的選擇性序列Gly-Tyr-Gly。在爪蟾卵細(xì)胞中突變的GIRK2(GIRK2mv)通道成為一個(gè)對(duì)K+,Na+,Ca2+均能通透的非特異性陽(yáng)離子通道,此外由GIRK2mv和GIRK1組成的異源性多聚體通道在體外表達(dá)系統(tǒng)中功能也減退。在神經(jīng)元內(nèi),這種通道不能被神經(jīng)遞質(zhì)激活形成正常的GIRK電流而使神經(jīng)元產(chǎn)生慢性去極化,并且可能引起神經(jīng)元死亡。Stefano等做成GIRK2基因敲除的小鼠(GIRK2-/-小鼠),GIRK2-/-小鼠與Weaver小鼠不同,它的小腦中除不含GIRK2和GIRK1減少外,小腦的形態(tài)正常;中腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元和其樹突除不含GIRK2蛋白外形態(tài)也正常。這就提示weaver小鼠的異常表現(xiàn)是由于GIRK2的功能異常而不是因缺少GIRK2所致,突變的GIRK2導(dǎo)致了發(fā)育的異常。研究還發(fā)現(xiàn)GIRK2-/-小鼠表現(xiàn)為多種形式的間歇性癲癇發(fā)作,并且發(fā)作可被環(huán)境因素和藥物PTZ誘發(fā)。Paul等比較了正常小鼠、weaver小鼠和GIRK2基因敲除小鼠的小腦顆粒細(xì)胞的GIRK電流,發(fā)現(xiàn)weaver小鼠和GIRK2基因敲除小鼠的GAB