復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病腦梗塞大鼠胰島素抵抗的干預(yù)作用

復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病腦梗塞大鼠胰島素抵抗的干預(yù)作用

腦梗死是老年人的常見(jiàn)疾病。由于腦動(dòng)脈粥樣硬化,使腦動(dòng)脈管腔狹窄,血管內(nèi)膜損傷,進(jìn)而因多種因素使局部血栓形成,加重動(dòng)脈狹窄或使腦動(dòng)脈完全閉塞,導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧、壞死,進(jìn)而引起各種神經(jīng)功能障礙的一種腦血管病。腦梗塞同時(shí)也是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),糖尿病性腦血管病變的發(fā)生率是非糖尿病患者的3倍以上。國(guó)內(nèi)外許多研究認(rèn)為,老年人群胰島素抵抗(InsulinResistance,IR)的發(fā)生率升高,胰島素抵抗是導(dǎo)致腦梗塞發(fā)生的危險(xiǎn)因素,在老年缺血性腦血管病的發(fā)病中是最重要的誘因之一,并可能是一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素,腦動(dòng)脈硬化程度與胰島素抵抗程度有正相關(guān)的平行關(guān)系。胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致不同程度的脂質(zhì)代謝紊亂、血液流變學(xué)改變以及血糖、血脂、血黏度升高,加重動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣硬化的程度,從而導(dǎo)致腦梗塞的反復(fù)發(fā)生并加重腦梗塞的癥狀。為了探討復(fù)元醒腦湯對(duì)于糖尿病腦梗塞的干預(yù)的作用機(jī)制,本課題采用糖尿病大鼠制作自體血栓性腦梗塞模型,開(kāi)展復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病腦梗塞大鼠胰島素抵抗的干預(yù)作用的研究,以期從腦梗塞加重胰島素抵抗的角度解釋復(fù)元醒腦湯治療糖尿病腦梗塞的機(jī)制,為中醫(yī)藥治療老年糖尿病腦梗塞提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),并進(jìn)一步豐富中醫(yī)治療危急重癥的理論與實(shí)踐。1動(dòng)物腦梗塞模型本模型在鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)致糖尿病模型的基礎(chǔ)上采用自體血栓法制備大腦中動(dòng)脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)局灶性糖尿病腦梗塞SD大鼠模型。1.1材料表面1.1.1fp3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心雄性SD大鼠120只,體質(zhì)量(200±20)g,SPF級(jí),由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院科技樓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證:SCXK(滬)2011-009。1.1.2益母草醇提物及其馬蘇烷酸酯樣品復(fù)元醒腦湯(人參10g單煎、三七10g、石菖蒲12g、水蛭10g、益母草30g、生南星15g、制大黃9g后下等),由本院制劑室生產(chǎn)提供,濃度為388g生藥/L。鏈脲佐菌素(STZ),Sigma,批號(hào):040105;凝血酶,Sigma,批號(hào):036k8600。1.1.3儀器、試劑和儀器FA2004B電子天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司;強(qiáng)生血糖儀,上海強(qiáng)生公司;激光多普勒血流儀,深圳市瑞沃德生命科技有限公司;大鼠腦立體定位儀,深圳市瑞沃德生命科技有限公司;恒宇電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;紫外分光光度計(jì),美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn);微電腦電子微量注射泵,上海電子儀器廠產(chǎn)品。1.2方法1.2.1各組大鼠造模及灌胃SPF級(jí)SD雄性大鼠120只,根據(jù)隨機(jī)原則分為2組,分別為:正常組24只和糖尿病模型組96只。糖尿病造模成功后不進(jìn)行治療,高脂飼料喂養(yǎng)2w后,將糖尿病大鼠隨機(jī)平均分為糖尿病組、腦梗塞假手術(shù)組、模型組、治療組4組。造模完成后分別灌胃,治療組每日以復(fù)元醒腦湯灌胃10.4g/kg體質(zhì)量(參照陳奇主編《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》依實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積比計(jì)算),正常組、糖尿病組、假手術(shù)組、模型組予等容量的生理鹽水灌胃,每天2次,連續(xù)3～7d。末次灌胃后,分別檢測(cè)各組大鼠血糖、血清胰島素、穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注率等指標(biāo)。1.2.2stz分次注射未成模將STZ試劑溶于PH4.6的檸檬酸鈉緩沖液中(現(xiàn)配現(xiàn)用),大鼠接受腹腔注射STZ試劑(50mg/kg),1w后成模(血糖>16.7mmol/L),并連續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)2w。1.2.3格局內(nèi)血栓形成的模型(1)制作血栓:將模型組、治療組兩組糖尿病大鼠用3%戊巴比妥鈉按0.15mL/100g體質(zhì)量劑量麻醉后,先暴露其股靜脈抽取靜脈血0.5mL加入預(yù)先加有75U凝血酶的EP管中,立即混勻。然后用注射器吸取沉淀部分注入2根頭皮針?biāo)芰瞎軆?nèi),靜置15min再打進(jìn)盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中,洗掉凝血塊表面的紅細(xì)胞。在顯微鏡下選擇富含纖維素(深色)的血栓剪切成1～2mm的小段,再轉(zhuǎn)入PH7.4的PBS緩沖液中恒溫(37℃)靜置5h使其凝縮,然后吸入EP50管中備用。(2)制作腦梗塞模型:將大鼠依前法麻醉后用眼科鑷子鈍性分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈,用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈,用提前制備好的1mL注射器針頭(將頭處折一個(gè)90°的平鉤)在頸外動(dòng)脈上挑刺出一個(gè)小口。將吸入血栓的EP50導(dǎo)管由頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈,松開(kāi)頸內(nèi)動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾。緩慢將血栓注入頸內(nèi)動(dòng)脈,用生理鹽水沖管后拔出EP50導(dǎo)管,結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端。松開(kāi)頸總動(dòng)脈夾,縫合肌肉和皮膚。(3)假手術(shù)組不將導(dǎo)管插入頸外動(dòng)脈,其余操作與手術(shù)組相同,手術(shù)過(guò)程中控制動(dòng)物肛溫在(37±0.5)℃。1.2.4模型制作、輸注及輸注率檢測(cè)(1)血糖、血清胰島素測(cè)定及胰島素敏感指數(shù):每組隨機(jī)抽取6只大鼠在模型組接受自體血栓手術(shù)后12h分別用毛細(xì)玻璃管從尾靜脈取血測(cè)血糖、血清胰島素值,然后計(jì)算其胰島素敏感指數(shù):ISI=ln[1/(FBG×FINS)](ln為自然對(duì)數(shù))。(2)神經(jīng)缺損行為體征評(píng)分:各組分別接受治療后3d,采用J.B.Bederson法對(duì)各組大鼠神經(jīng)缺損行為評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分。待大鼠清醒后,每組隨機(jī)選取12只大鼠進(jìn)行評(píng)分(根據(jù)J.B.Bederson神經(jīng)缺損行為體征評(píng)分法):輕提鼠尾,使其頭部高于地面10cm,正常大鼠兩側(cè)前爪前伸。分級(jí):0級(jí)(0分):無(wú)明顯神經(jīng)缺損癥狀;I級(jí)(1分):梗塞對(duì)側(cè)前肢回收屈曲內(nèi)收,同側(cè)前肢向地面伸展;Ⅱ級(jí)(2分):I級(jí)體征+俯臥于桌面時(shí)從梗塞側(cè)向?qū)?cè)推動(dòng)大鼠時(shí)阻力降低;Ⅲ級(jí)(3分):I級(jí)體征+Ⅱ級(jí)體征+大鼠行走時(shí)向梗塞對(duì)側(cè)肢體旋轉(zhuǎn)(呈追尾狀),甚至傾倒。分值≥1分為模型制作成功。(3)穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注率:穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注率(glucoseinfusionrate,GIR)測(cè)定方法:各組大鼠均禁食12h,用3%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔內(nèi)麻醉(45mg/kg體質(zhì)量)。麻醉顯效后,將雙側(cè)項(xiàng)部皮膚剪開(kāi),鈍性分離并暴露出右側(cè)頸動(dòng)脈和左側(cè)頸靜脈,分別在左側(cè)頸靜脈和右側(cè)頸動(dòng)脈插管:左側(cè)頸靜脈置入一支三通管,分別在其兩側(cè)各連接一個(gè)裝有生理鹽水的注射器,再將一支裝有肝素生理鹽水(濃度為40U/mL)的注射器與頸動(dòng)脈導(dǎo)管相連,每隔5min推動(dòng)一次注射器沖洗導(dǎo)管,防止血液凝固堵塞導(dǎo)管,同時(shí)用肝素系統(tǒng)抗凝(首次60U/kg,以后每小時(shí)25U/kg)。術(shù)中大鼠體溫應(yīng)控制在37℃左右,注意保溫并隨時(shí)用肛表監(jiān)測(cè)體溫。插管完畢后,將大鼠靜置30min。將左側(cè)頸靜脈三通管的一側(cè)連接一個(gè)裝有胰島素溶液的30mL注射器,另一側(cè)接一個(gè)裝有10%葡萄糖溶液的30mL注射器。將這兩個(gè)注射器分別安裝到兩個(gè)微量注射泵上進(jìn)行持續(xù)推注。先行持續(xù)胰島素(1.5mU·Kg-1·min-1)輸注5min后,從導(dǎo)管中取一滴血測(cè)血糖值。如果測(cè)出的血糖值超出基礎(chǔ)值±0.5mmol/L的范圍,即可進(jìn)行葡萄糖輸注,輸注速度一般從4～6mg·Kg-1·min-1開(kāi)始。如果血糖值仍保持在該范圍,則在5min后再測(cè)一次血糖,直到超出上述范圍至可進(jìn)行葡萄糖輸注為止。葡萄糖輸注開(kāi)始后仍舊每5-10min測(cè)一次血糖,并根據(jù)血糖值盡快調(diào)節(jié)葡萄糖輸注速率,使血糖恢復(fù)到基礎(chǔ)值±0.5mmol/L。如此反復(fù)進(jìn)行。當(dāng)連續(xù)3次所得血糖值均在上述范圍內(nèi)時(shí),便達(dá)到胰-糖穩(wěn)定狀態(tài),即所謂的“鉗夾形成”,此時(shí)的葡萄糖輸注速率即為穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注率。1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);等級(jí)資料采用Ridit分析;檢驗(yàn)效能以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1糖尿病腦梗塞模型如表1所示,正常組(N)、假手術(shù)組(S)、糖尿病組(DM)、治療組(T)與糖尿病腦梗塞模型組(DMCI)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。2.2顯示神經(jīng)缺損綜合征的癥狀從表2可知,各組大鼠神經(jīng)缺損恢復(fù)情況:糖尿病腦梗塞模型組和其他各組之間差異也具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。3糖尿病腦梗塞病機(jī)糖尿病并發(fā)腦梗塞的患者多為老年人,《素問(wèn)·上古天真論》云:“女子七七”、“男子八八”,“天癸絕”,腎精虧虛加之形神俱傷可為本病的發(fā)病基礎(chǔ)。元代醫(yī)家沈金鰲認(rèn)為“元?dú)馓摓橹酗L(fēng)之根”;加之消渴病患者病情遷延日久,臟腑功能減退,津虧無(wú)以濡養(yǎng),生化衰敗,元?dú)馍υ?痰淤等病理產(chǎn)物“應(yīng)運(yùn)而生”。痰淤互阻堵塞脈絡(luò),導(dǎo)致經(jīng)筋氣血運(yùn)行不利,日久化火生風(fēng),風(fēng)火相煽,遂發(fā)“中風(fēng)”。中醫(yī)的認(rèn)識(shí)多為“消渴病”合并“中風(fēng)”,中醫(yī)對(duì)于這兩種疾病的發(fā)現(xiàn)以及認(rèn)識(shí)歷史悠久、經(jīng)驗(yàn)豐富。其理論淵源最早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有記載,該病的病機(jī)一般以氣陰兩虛、脈絡(luò)淤阻多見(jiàn),另外還和風(fēng)、火、痰、虛等病邪密切相關(guān)。我們?cè)陂L(zhǎng)期臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn),糖尿病腦梗塞的發(fā)病主要以元?dú)馓摀p為根本,痰瘀互結(jié)、痰熱生風(fēng)為病機(jī)核心。據(jù)此,復(fù)元醒腦湯(人參、三七、水蛭、生南星、益母草、大黃等)固本培元、益氣養(yǎng)陰為主,佐以瀉熱熄風(fēng)、逐瘀化痰、開(kāi)竅通絡(luò)之法治療糖尿病腦梗塞。前期臨床研究表明復(fù)元醒腦湯治療中風(fēng),在提高療效,降低病死率,減輕胰島素抵抗及改善神經(jīng)功能恢復(fù)等方面取得顯著效果。胰島素抵抗高發(fā)于老年人,是機(jī)體需要分泌更高的胰島素量以維持正常血糖水平的一種狀態(tài)。近年研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)的腦組織內(nèi)也存在胰島素及其受體。學(xué)界推測(cè),腦組織內(nèi)的胰島素來(lái)源于血液中攝取和腦細(xì)胞內(nèi)合成這2條途徑。當(dāng)機(jī)體組織細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感度降低,體內(nèi)胰島素水平增高時(shí),就會(huì)導(dǎo)致各種代謝異常的發(fā)生。但各種組織器官的細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性并不一致,脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞較容易產(chǎn)生胰島素抵抗,而肝、腎及血管等組織對(duì)胰島素反應(yīng)波動(dòng)較小,高胰島素血癥的危害正是由這種不平衡所導(dǎo)致。諸多臨床研究發(fā)現(xiàn)腦梗塞病人胰島素敏感指數(shù)均低于正常對(duì)照組,說(shuō)明胰島素抵抗現(xiàn)象存在于腦梗塞病人體內(nèi)。腦梗塞病人的高胰島素血癥并非全部來(lái)自于應(yīng)激反應(yīng),而是由于梗塞區(qū)域細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性下降所致,