復元膠囊對兔膝骨關節(jié)炎軟骨中igf-i、igfbp3表達的影響

復元膠囊對兔膝骨關節(jié)炎軟骨中igf-i、igfbp3表達的影響

骨關節(jié)炎（oa）是老年人常見的一種常見的關節(jié)疾病，主要是關節(jié)軟骨的周期性退行性變。軟骨合成與降解失衡是其退變的主要病理機制,而細胞生長因子和炎癥細胞因子又是介導軟骨合成與降解失衡的重要生化因素。IGF-I作為一種具有促生長作用的重要調控因子,能夠促進軟骨細胞增殖和基質合成,這與中醫(yī)“主骨生髓”觀點類似,因此常用補腎法防治骨關節(jié)炎。復元膠囊具有補腎活血作用,可通過降低炎癥因子IL-1β、IL-6表達,抑制軟骨降解,但該方在促進軟骨合成方面還有待于研究。本實驗建立兔膝骨關節(jié)炎模型,觀察軟骨IGF-I、IGFBP3表達,探討復元膠囊防治膝骨關節(jié)炎的作用機制。1材料和方法1.1復元膠囊的制備重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供的健康新西蘭大白兔44只,雌雄各半,體重(2.5±0.4)kg。合格證:SCXK(渝)20090011。實驗藥物復元膠囊由鹿茸、淫羊藿、生曬參、黃芪、丹參等組成,重慶希爾安藥業(yè)有限公司生產(chǎn),每粒膠囊重0.41g,相當于生藥3g,僅供實驗使用。對照藥物鹽酸氨基葡萄糖膠囊(奧泰靈)由香港澳美制藥公司生產(chǎn)(國藥準字Z20088501),規(guī)格為每粒含鹽酸氨基葡萄750mg。IGF-I抗兔多克隆抗體、IGFBP3抗兔多克隆抗體、SP免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒由北京博奧森生物技術有限公司提供。1.2方法1.2.1小組將44只新西蘭大白兔隨機分為正常組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組、復元膠囊低、中、高劑量組。正常組4只,其余各組8只,每只均單籠飼養(yǎng)。1.2.2現(xiàn)行膝關節(jié)培養(yǎng)法所有實驗動物同等條件下適應性飼養(yǎng)1w后,除正常組外,其余各組采用右后肢膝關節(jié)伸直石膏固定法造模:實驗兔放入固定器,先剪去右后肢踝關節(jié)以上的兔毛,用醫(yī)用紗布裹上兩層,再用管型石膏將其伸直位固定,石膏外以透明膠紙封好,若石膏松動或脫落者及時重新固定,持續(xù)6w,造成膝骨關節(jié)炎模型。1.2.3等效劑量及復元膠囊根據(jù)Meeh-Rubner公式,按成人(60kg)體表面積與家兔體表面積換算等效劑量,復元膠囊中劑量組給予等效劑量2700mg·kg-1·d-1,復元膠囊低劑量組1350mg·kg-1·d-1,復元膠囊高劑量組5400mg·kg-1·d-1,鹽酸氨基葡萄糖組90mg·kg-1·d-1。造模后1w開始給藥,除正常組和模型組外,各組藥物飲用水溶解后灌胃,1次/d,持續(xù)6w。1.2.4骨下骨折組用藥6w后,處死實驗動物,切取股骨內(nèi)側髁完整軟骨及軟骨下骨組織標本,其中正常組取雙后肢軟骨做標本,用4%多聚甲醛溶液固定20h,15%EDTA脫鈣3～5w,磷酸鹽緩沖液充分沖洗,石蠟縱向包埋固定,常規(guī)切片。1.2.5不同高倍視野的選取按照免疫組織化學染色法(SP法)操作說明檢測IGF-I、IGFBP3表達。每張切片選取6個高倍視野(400倍),其中三個視野包括表中層、三個視野包括中深層,由兩個不同觀察者完成。細胞染色為黃色或棕色為陽性細胞,參考Pelletier等方法計算每個高倍視野下的陽性細胞計數(shù)和細胞總數(shù)。IGF-I、IGFBP3陽性軟骨細胞用細胞分數(shù)表示。1.3統(tǒng)計分析應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,采用單因素方差分析,兩組間比較用LSD-t檢驗。2結果2.1各組小鼠海馬綠染色及胞核的染色正常組軟骨僅在表層和中上層見到少許陽性細胞;模型組軟骨細胞可見不同程度著色,軟骨細胞的胞漿及胞核可見黃色及棕色著色,IGF-I以核染色為主,IGFBP3以胞漿染色為主,軟骨各層均可見陽性細胞,但以中層更為顯著;模型組與鹽酸氨基葡萄糖組無明顯差異;復元膠囊各劑量組IGF-I表達陽性細胞增多,著色棕黃為主,IGFBP3表達陽性細胞相對減少,著色淡黃為主。見圖1。2.2模型各組igf-i、igfbp3表達積分的比較模型組IGF-I、IGFBP3表達積分與正常組比較均升高(P<0.01)。復元膠囊各組與模型組比較,IGF-I表達積分不同程度升高,而IGFBP3表達積分則不同程度降低(P<0.05,P<0.01),高劑量組顯著。復元膠囊中高劑量組與鹽酸氨基葡萄糖組比較,IGF-I表達積分升高,IGFBP3表達積分降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。3復元膠囊治療骨關節(jié)炎的作用機制IGF-I是人體內(nèi)一種與胰島素結構相似的重要生長因子,主要由肝臟、骨及軟骨組織細胞合成,通過內(nèi)分泌、旁分泌或自分泌方式作用于靶器官,與組織細胞表面IGF-I受體結合后,激活PI3K和MAPK信號通路發(fā)揮多種生物學效應,可以促進細胞增殖、細胞分化、細胞遷移,抑制細胞凋亡,調節(jié)生長發(fā)育,機體代謝,抗衰老等過程,對機體多個系統(tǒng)的損傷及修復具有十分重要的作用。在軟骨中IGF-I通過促進軟骨細胞產(chǎn)生基質多糖和膠原蛋白,抑制軟骨細胞凋亡,維持軟骨合成與降解平衡,但IGF-I這一生理效應受胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBPs)調控,IGFBPs與IGF-I結合可以降低IGF-I與其受體之間的親和力,從而抑制了IGF-I的生物活性。OA以軟骨退行性改變?yōu)橹饕憩F(xiàn),勢必存在軟骨細胞分泌IGF-I不足,但事實上則相反,國外研究證實在骨關節(jié)炎軟骨細胞中IGF-ImRNA表達增加,比正常高3.5倍,IGFBP3表達也增加,且比正常高24倍。軟骨細胞合成IGF-I增加,理應能夠促進軟骨合成而發(fā)揮自我修復,但是軟骨病理形態(tài)改變并沒有因此減輕,這可能與IGFBP3表達增加更多有關。IGFBP3表達增加,與IGF-I結合增多,抑制IGF-I與其受體結合,從而IGF-I促軟骨合成效能降低,導致軟骨退變。OA相當于中醫(yī)“骨痿”“骨痹”范疇。中醫(yī)認為本病多因年邁肝腎虧虛,氣血不足,風寒濕邪侵入骨骼,以致血瘀阻經(jīng)絡所致。腎藏精,主骨生髓;腎精足則骨髓充,骨骼得以滋養(yǎng),筋骨堅強。本病主要病機特點為本虛標實,本痿標痹,以腎精不足,筋骨失養(yǎng)為本,以痰濕血瘀,痹阻筋絡關節(jié)為標。復元膠囊從臨床上治療骨關節(jié)炎行之有效的復元湯化裁而來,由鹿茸、淫羊藿、丹參、生曬參、黃芪等中藥配伍而成,具有補腎活血益氣之效。前期研究提示該藥可以通過降低骨關節(jié)炎軟骨中IL-1表達,增強TGF-β2表達,調節(jié)MMPs/TIMPs平衡起到防治骨關節(jié)炎的作用?，F(xiàn)代研究表明鹿茸提取物和淫羊藿提取物能夠促進軟骨細胞增殖、基