2023年分子診斷知識(shí)點(diǎn)

1、基因（gene）是具有生物信息的DNA功能片段,根據(jù)這些生物信息可以編碼具有生

物功能的產(chǎn)物，涉及RNA和蛋白質(zhì)（多數(shù)）.

2、基因組genome,指細(xì)胞或生物體一套完整的遺傳物質(zhì)，涉及所有基因和基因間的

區(qū)域（序列）。

3、基因組學(xué)genomics以基因組為研究對(duì)象的一門學(xué)科，涉及基因組作圖、基因組測(cè)序、

基因定位、基因功能分析

4、結(jié)構(gòu)基因：編碼RNA或蛋白質(zhì)的核甘酸序列

5、基因表達(dá)：DNA攜帶遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA,mRNA通過翻譯將基因的遺傳

信息在細(xì)胞內(nèi)合成具有生物功能的各種蛋白質(zhì)的過程

6、C值基因組DNA所有堿基（對(duì)）數(shù)。C值是物種的一個(gè)重要特性常數(shù)。C值矛

盾，C值悖論：生物體的進(jìn)化限度與基因組大小之間不完全成比例的現(xiàn)象

7、N值矛盾，N值悖論:基因組中的基因數(shù)目與生物進(jìn)化限度或復(fù)雜限度的不對(duì)稱性

8、必需基因（致死基因）關(guān)系到生物體存活的基因?？赏ㄟ^基因突變實(shí)驗(yàn)擬定必需基

因。：

9、原核生物基因組1、細(xì)菌、支原體、立克次體、衣原體、螺旋體、放線菌、藍(lán)綠藻等

10、重疊基因:是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序

列為兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的組成部分。

11、操縱子：由一組功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因連同其上游調(diào)控序列共同組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位

12、質(zhì)粒的分類致育質(zhì)粒F質(zhì)粒）編碼性菌毛，介導(dǎo)細(xì)菌之間的接合傳遞；耐藥性質(zhì)粒

R質(zhì)粒）編碼細(xì)菌對(duì)抗菌藥物或重金屬鹽類的耐藥性；毒力質(zhì)粒Vi質(zhì)粒）編碼與該

菌致病性有關(guān)的毒力因子；細(xì)菌素質(zhì)粒編碼細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌素；代謝質(zhì)粒編碼產(chǎn)生相關(guān)

的代謝酶。

13、嚴(yán)緊控制型拷貝數(shù)少，一般＜10個(gè)，分子量大；調(diào)節(jié)因子是蛋白質(zhì)，復(fù)制受限，受染

色體DNA復(fù)制系統(tǒng)的控制；嚴(yán)謹(jǐn)控制機(jī)理（低拷貝因素），認(rèn)為是該質(zhì)?？梢援a(chǎn)生阻遏蛋

白,反饋克制自身DNA合成。松弛控制型拷貝數(shù)多，10-200個(gè)，分子量小；調(diào)節(jié)因子是

RNA,復(fù)制不受染色體DNA復(fù)制系統(tǒng)限制基因工程使用松弛型（高拷貝數(shù)）質(zhì)粒，以獲

得較多的基因產(chǎn)物。

14、質(zhì)粒性質(zhì)

1、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移:可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合作用而由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌細(xì)

胞中，使兩個(gè)細(xì)胞都成為帶有質(zhì)粒的細(xì)胞；質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時(shí)，它可以單獨(dú)轉(zhuǎn)移，也可以攜帶著染

色體（片段）一起進(jìn)行轉(zhuǎn)移，所以它可成為基因工程的載體。

2、質(zhì)粒具有選擇性標(biāo)記:質(zhì)粒有抗藥性基因、營養(yǎng)缺陷型基因、抗重金屬鹽基因等多種

選擇性標(biāo)記

3、質(zhì)粒的不相容性:質(zhì)粒已成為分子克隆的有用工具,是目的DNA的載體。載體質(zhì)粒大

多是在天然質(zhì)粒基礎(chǔ)上經(jīng)人工構(gòu)建而成，

15、質(zhì)粒特點(diǎn)：1、有限制性核酸內(nèi)切酶單一切口，可用以重組外源DNA；2、有篩選標(biāo)

記，如抗藥基因等；3、插入外源DNA后,仍能轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并能復(fù)制。

16、質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)移的方式1.接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛互相接觸時(shí)，質(zhì)粒

DN從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用2.轉(zhuǎn)化作用通

過自動(dòng)獲取或人為地供應(yīng)外源DNA,使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為

轉(zhuǎn)化作用3、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（受體）細(xì)

胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用4、轉(zhuǎn)染作

用通過感染方式將外來DNA引入宿主細(xì)胞，并導(dǎo)致宿主細(xì)胞遺傳性狀改變的過程稱為

轉(zhuǎn)染（transfection）。轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。

17、完整的病毒顆粒涉及：衣殼、基因組（DNA或RNA）、被膜、病毒顆粒中的其

他內(nèi)容物

18、病毒分段基因組:流感病毒屬分段RNA病毒：意義:a）減少包裝壓力b）減少了

造成斷裂的也許性,提高編碼能力c）有分段基因組的病毒一般感染效率較低，只有所有基

因組核酸片段存在時(shí)，病毒才具有感染能力。植物病毒d）由于分段基因組易發(fā)生重組，故病

毒容易變異。19、病毒基因組特點(diǎn)：1、有特殊的末端序列:粘性末段、反向互補(bǔ)序列、長

末端反復(fù)序列、帽和尾結(jié)構(gòu)等；2、結(jié)構(gòu)緊密，體現(xiàn)在不僅非編碼序列少，并且有重疊基

因的存在；真核生物

20、染色體的包裝：（1）染色體的一級(jí)結(jié)構(gòu)一核小體（2）染色體的二級(jí)結(jié)構(gòu)一螺線管3）

染色體的三級(jí)結(jié)構(gòu)一超螺線管（4）染色體的四級(jí)結(jié)構(gòu)一染色單體

21、真核生物染色體基因組一般特性1、真核生物的基因組比較龐大;2、線性雙鏈DNA

和二倍體;3、真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。4、存在反復(fù)序列，反復(fù)次數(shù)可達(dá)百

萬次以上5、基因是不連續(xù)的（斷裂基因）

22、單順反子:一個(gè)結(jié)構(gòu)基因通過轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA分子，再翻譯生成一種蛋白質(zhì)：

23、反復(fù)序列:指多拷貝的相同或近似序列的DNA片段高度反復(fù)序列：按其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為

三種：1、反向反復(fù)序列2、衛(wèi)星DNA由于這類序列的堿基組成不同于其他部份，可用

等密度梯度離心法將其與主體DNA分開,因而稱為衛(wèi)星DNA（或隨體DNA）3、較復(fù)雜

的反復(fù)單位組成的反復(fù)順序中度反復(fù)順序：依據(jù)反復(fù)順序的長度，中度反復(fù)順序可分為:

短散布元件和長散布元件Alu家族是哺乳動(dòng)物基因組中含量最豐富的一種中度反復(fù)順序家

族（短分散元件），Alu家族每個(gè)成員的長度約300bp，每個(gè)單位長度中有一個(gè)限制性

內(nèi)切酶Alul的切點(diǎn)（AGICT）,A1u可將其切成長130和170bp的兩段，因而

定名為Alu序列（或Alu家族）

24、斷裂基因（splitgene）：真核生物的結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)相間隔但

又連續(xù)鑲嵌而成，為一連續(xù)的氨基酸組成的完整的蛋白質(zhì)編碼，或?yàn)榫哂刑厥夤δ艿膖RN

A或rRNA編碼,因此稱為斷裂基因。并非真核生物所有的結(jié)構(gòu)基因均為splitting

gene例：組蛋白基因家族、干擾素、酵母中多數(shù)基因

25、線粒體DNA的遺傳特性：母系遺傳、突變率高、異質(zhì)性、閾值效應(yīng)、半自助復(fù)制

與協(xié)同效應(yīng)

26、閾值效應(yīng)：mlDNA突變導(dǎo)致氧化磷酸化水平減少，當(dāng)突變的mlDNA達(dá)成一定比例

時(shí)，使得線粒體總的能量供應(yīng)減少到維持組織正常功能所需能量的最低值時(shí)，才也許引起某

組織或器官的功能異常而出現(xiàn)臨床癥狀。

27、DNA分子多態(tài)性的重要方式：微衛(wèi)星DNA多態(tài)性（同一位點(diǎn)不同個(gè)體之間有不同

長度的微衛(wèi)星DNA）、單個(gè)核甘酸的變異一單核甘酸多態(tài)性（SNP）等

28、STR結(jié)構(gòu)：微衛(wèi)星DNA又稱短串聯(lián)反復(fù)STR,指以1-6個(gè)堿基為核心單位串聯(lián)重

復(fù)而成的一類序列。微衛(wèi)星DNA結(jié)構(gòu)序列由中間的核心區(qū)（反復(fù)序列）和外圍的側(cè)翼區(qū)

（非反復(fù)序列）組成，其核心序列為l~6bp,為高度反復(fù)序列。成因：1.姊妹染色單體的

不均等互換2.復(fù)制滑移

29、SNP:SNP是基因組中散在的單個(gè)核甘酸的變異形成的一種DNA分子多態(tài)性位置:

編碼區(qū)SNPcSNP）、基因周邊區(qū)SNPpSNP）基因間SNPiSNP）SNP非編、碼

區(qū)：SNP編碼區(qū)=5:1成因:單個(gè)核昔酸（堿基）置換：轉(zhuǎn)換：U密噬一嚏咤，喋吟一

喋吟；顛換：喀咤一喋吟，喋吟一喀咤轉(zhuǎn)換:顛換=3:1。

蛋白質(zhì)組

1、蛋白質(zhì)組：生物體的全套蛋白質(zhì)；或一個(gè)生命單位的全套蛋白質(zhì)

2、蛋白質(zhì)組特性:與基因組相比，蛋白質(zhì)組有高度動(dòng)態(tài)性:有組織特異性、生長發(fā)育特異

性、生理病理狀態(tài)特異性。

3、研究的必要性：1、蛋白質(zhì)的數(shù)量比基因的數(shù)量多（轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后水平的調(diào)控）

2、基因組是靜態(tài)的，蛋白質(zhì)組是動(dòng)態(tài)的3、蛋白質(zhì)之間及其與其它各種大、小分子之間的

廣泛作用形成的如同網(wǎng)絡(luò)狀的復(fù)雜系統(tǒng)。

4、蛋白質(zhì)組學(xué)是研究生物體全套蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)與功能的科學(xué)

5、蛋白質(zhì)的分離：雙向凝膠電泳及圖像分析技術(shù)1、雙向凝膠電泳2-DE：第歷來的

固相pH梯度等電聚焦電泳1PG-IEF第二向SDS-PAGE組成的分離系統(tǒng)：電泳速度

只與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量有關(guān)。原理:等電聚焦電泳:基于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（PI）的差異進(jìn)行分離；

聚丙烯酰胺凝膠電泳:是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量（Mw）的不同進(jìn)行分離

6、質(zhì)譜技術(shù)MS：（用于蛋白質(zhì)的鑒定）是在高真空系統(tǒng)中樣品分子離子化后，根據(jù)不同

離子間質(zhì)荷比差異，以擬定樣品相對(duì)分子質(zhì)量及分子結(jié)構(gòu)的技術(shù)。

7、質(zhì)譜：化合物分子受到電子流沖擊后，形成的帶正電荷分子離子及碎片離子，按照其質(zhì)

荷比大小依次排列而被記錄下來的圖譜，稱為質(zhì)譜。8、質(zhì)譜儀的組成：離子源、質(zhì)量分

析器、檢測(cè)器

核酸分子雜交

1、核酸變性：在理化因素作用下，維系DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力遭到破壞，

DNA雙螺旋的兩條互補(bǔ)鏈松散而分開成為單鏈，從而導(dǎo)致DNA的理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)發(fā)

生改變

2、核酸復(fù)性:變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過

程，稱復(fù)性或雜交。

3、分子雜交:不同來源的核酸變性后，合并在一起，只要這些核酸分子具有可以形成堿基

互補(bǔ)配對(duì)的序列，復(fù)性也會(huì)發(fā)生在不同來源的核酸鏈之間，形成雜化雙鏈

4、分子雜交技術(shù):用標(biāo)記的已知DNA或RNA片段（探針）來檢測(cè)樣品中未知核酸序列,

通過核甘酸間堿基互補(bǔ)的原則發(fā)生異源性結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合核酸序列

的位置或大小顯示出來的技術(shù)。待測(cè)的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未

克隆化的基因組DNA和組織細(xì)胞的DNA、RNA。

5、核酸探針:指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)雜交，雜交后可用特殊方法檢測(cè)的、帶

有標(biāo)記的、并已知堿基序列的核酸片段。

6、原位雜交:以特定標(biāo)記的已知序列的核酸分子作為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜

交并對(duì)其檢測(cè)的方法

7、寡核甘酸探針的特點(diǎn)及設(shè)計(jì)原則?特點(diǎn)：（1）根據(jù)需要來合成相應(yīng)的核酸序列，避免

了天然探針的缺陷；（2）大多數(shù)寡核甘酸探針長度較短，一般為10~5Obp,其序列復(fù)雜度

低，所以和等量靶位點(diǎn)完全雜交的時(shí)間比克隆探針短；（3）寡核甘酸探針特別適合點(diǎn)突

變的檢測(cè)（短探針中堿基的錯(cuò)配能大幅度地減少雜交體的Tm值）；（4）探針的長度較

短，特異性較低，雜交信號(hào)較弱。設(shè)計(jì)原則：（1）探針長度:一般規(guī)定在10~5Obp;（2）

G/C含量為40%~60%;（3）探針分子中應(yīng)避免互補(bǔ)序列；（4）避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)，

一般不能多于4個(gè)；（5）探針與非靶基因序列的同源性不能超過70%或8個(gè)以上連續(xù)

的堿基同源。

8、一個(gè)抱負(fù)的探針標(biāo)記物應(yīng)具有的特性？I、靈敏度高2、標(biāo)記物與探針結(jié)合后，應(yīng)不影響

雜交反映，特別是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值3、標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)方法無干擾4、檢測(cè)

方法要靈敏、特異、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便5、標(biāo)記物對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)人體無損傷，價(jià)格低廉。

9、Southern印跡雜交的基本環(huán)節(jié)？其毛細(xì)管轉(zhuǎn)膜的原理?Southern印跡指將電泳分離

的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程?；经h(huán)節(jié)：1、基因組DNA經(jīng)限制酶

消化后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳2、將具有DNA片段的凝膠放入變性溶液使DNA變性3、

將固體支持物放在凝膠上，通過毛細(xì)管虹吸或電轉(zhuǎn)移將腳上的DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持

物上，轉(zhuǎn)移過程中，各DNA片段間的相對(duì)位置保持不變，然后通過加熱使DNA固定于膜上

4、加入探針使之與膜上的DNA雜交5、沖洗掉為雜交的探針，檢測(cè)雜交信號(hào)

10、毛細(xì)管虹吸印跡法其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液具有高濃度的NaC1和

檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜

向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯

留在膜上

11、原位雜交時(shí)組織和細(xì)胞應(yīng)固定解決，抱負(fù)固定液應(yīng)具有哪些條件?1、保持組織細(xì)胞的

形態(tài)2、對(duì)核酸無抽提，修飾與降解作用3、不改變核酸在組織細(xì)胞內(nèi)的定位4、不阻礙核

酸與探針的雜交過程5、對(duì)雜交信號(hào)無遮蔽作用6、理化性質(zhì)穩(wěn)定

12、如何增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性？組織細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核

酸蛋白復(fù)合體，影響探針的穿透和雜交體的形成；去垢劑和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白

質(zhì)；控制消化時(shí)間,避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻片上脫落分子克?。ㄒ卜Q基因克隆或D

NA克隆）：指按照人的意愿，在體外將制備的DNA片段與載體DNA重組，然后

導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，以獲得該DNA分子的大量拷貝的技術(shù)。又

稱重組DNA技術(shù)

1、制備目的基因重要有哪幾種方法？直接分離、人工合成、構(gòu)建基因組文庫G-文庫、構(gòu)

建cDNA文庫C-文庫

2、載體：是指能在連接酶作用下和外源DNA片段連接起來，并運(yùn)送到宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)

增或表達(dá)的運(yùn)載工具。載體化學(xué)本質(zhì)為DNA分子。克隆載體：能將外源基因在受體細(xì)

胞中復(fù)制擴(kuò)增并產(chǎn)生足夠量目的基因的載體稱為克隆載體表達(dá)載體：可以攜帶目的

DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增和表達(dá)，獲得目的DNA蛋白質(zhì)產(chǎn)物的一類DNA分子

3、轉(zhuǎn)化(transformation)以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的

過程稱為轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)染(transfaction)是指以噬菌體DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過

程稱為轉(zhuǎn)染。感染(infection)具有感染力的噬菌體將頭部重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程稱

為感染.4、重組子：具有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞重組體:不同來源的DNA通

過重組作用所組成的DNA分子重組DNA:不同來源的DNA通過磷酸二酯鍵連接而重新

組合成新的DNA分子的過程

5、G-文庫;將某種生物體的所有基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長

度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽

性菌落

6、C-文庫:將某種生物體基因組轉(zhuǎn)錄的所有mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA片段，再分別與克

隆

載體重組，儲(chǔ)存于某種受體菌中

7、基因組文庫：具有某種生物所有基因隨機(jī)片段的重組DNA克隆群

8感受態(tài)細(xì)胞:(competentcell)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增長并具有攝取外源DNA

能力的細(xì)胞。

9、2型限制酶：可以辨認(rèn)DNA的特異序列，并在辨認(rèn)位點(diǎn)或其周邊切割雙鏈DNA的一

類核酸內(nèi)切酶。命名:①限制性核酸內(nèi)切酶第一個(gè)字母(大寫，斜體)代表該酶的宿主菌屬名

第二、三個(gè)字母(小寫，斜體)代表宿主菌種名②第四個(gè)字母代表宿主菌的株或型③若從一

種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制性核酸內(nèi)切酶，即根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表達(dá)。

辨認(rèn)序列特點(diǎn)：具有回文結(jié)構(gòu)的DNA片段切割方式:在對(duì)稱軸處同時(shí)切割DNA的兩條

鏈、在對(duì)稱軸兩側(cè)相類似的位置切割兩條鏈末端類型:平末端和3*或5*突出的粘性末

端

10、DNA連接酶：是一種封閉DNA鏈上切口的酶催化反映的化學(xué)本質(zhì)：修復(fù)雙鏈

DNA上切口處的磷酸二酯鍵反映條件:DNA連接酶的反映條件Tris-HCl50-10Ommol/L

pH7.5MgC12lOmmo1/LATP0.5-lmmo1/LDTT5mmol/LVolume10-20LT

emperature4-15℃Time4-16h作用:可以催化兩個(gè)互補(bǔ)粘性末端或平末端雙鏈DNA

分子形成磷酸二酯鍵，實(shí)現(xiàn)DNA重組。連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子

11>DNA聚合酶:酶類：1、大腸桿菌DNA聚合酶12、T4DNA聚合酶3、逆

轉(zhuǎn)錄酶、4、TaqDNA聚合酶5、末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶6、大腸埃希菌DNA聚合

酶IK1enow大片段、7、T7DNA聚合酶:活性：1、大腸桿菌DNA聚合酶I:參

與DNA修復(fù)，具5'-3'核酸聚合酶活性、3'-5'和5'-3'外切酶活性2、T4

DNA聚合酶：有3'-5'的核酸外切酶活性、5'~3'的DNA聚合酶活性。3、逆轉(zhuǎn)

錄酶:⑴以單鏈RNA為模板，催化合成cDNA單鏈⑵從5*末端或3*末端降解

DNA雜合鏈中的DNA⑶以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。4、TaqDNA

聚合酶：有強(qiáng)的5'3'DNA聚合酶活性、有5'3'核酸外切酶活性、無3'

5'核酸外切酶活性5、末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移醐：標(biāo)記DNA的3'-OH末端;也可催

化載體分子或待克隆的DNA片段上加上互補(bǔ)的同聚尾，便于進(jìn)一步連接?；钚酝?

7、6、5*-3*聚合酶活性、3*—5*外切酶活性》2》6

12、工具酶作用限制酶：辨認(rèn)和切割雙鏈DNA連接酶連接兩個(gè)DNA分子聚合酶

DNA聚合、外切酶1聚合外切TaqDNA聚合酶聚合外切逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成末端

脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶3*末端聚合堿性磷酸能切除末端磷酸基T4多核甘酸激酶5*末端磷

酸化核酸酶S1水解單鏈核酸

13、載體篩選原理：通過某些特定方法，從被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體或基因文庫中，鑒別出真正

的重組子的過程

14載體特點(diǎn)：1、獨(dú)立復(fù)制2、篩選標(biāo)志3、較多拷貝數(shù)4、多克隆位點(diǎn)5、較高遺傳

穩(wěn)定性

14、幾種常用載體比較克隆容量受體細(xì)胞篩選原理質(zhì)粒載體《2Kb大腸桿菌pUC系

列藍(lán)白斑篩選pBR322雙抗生素篩選噬菌體載體大腸桿菌入噬菌體《22Kb藍(lán)

白斑篩選Ml3噬菌體《1Kb藍(lán)白斑篩選粘粒載體40-50Kb大腸桿菌酵母人工染色體

200-1000Kb酵母細(xì)胞病毒載體動(dòng)物細(xì)胞15、pBR322質(zhì)粒特點(diǎn)：1、相對(duì)分子質(zhì)

量好,4.363kb2、有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，為松弛復(fù)制子3、可用氯霉素?cái)U(kuò)增其質(zhì)?？截悢?shù)

4、有四環(huán)素、氨節(jié)霉素兩個(gè)基因5、有24種限制酶的單一辨認(rèn)點(diǎn)

16、pUC:pUC18/19質(zhì)粒載體是由pBR322質(zhì)粒和M13噬菌體重組構(gòu)建而成的雙鏈

DNA克隆載體。pUC是系列質(zhì)粒載體

17、pUC質(zhì)粒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1）pUC載體較小,全長僅2686bp；具有更高的拷貝數(shù)

2）只保留了一個(gè)藥物抗性基因Ampr3）大腸桿菌B半乳糖首酶基因的啟動(dòng)子及其編碼

a-肽鏈的DNA序列一一LacZ'基因；4）有一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，極有助于克隆外源基

因。

16、分子克隆的基本環(huán)節(jié)分:目的基因的獲得（基因文庫、逆轉(zhuǎn)錄、人工合成、從基因組

分離）、載體的獲得切：限制酶切割目的基因和載體，產(chǎn)生平末端或相同的粘性末端；接：

連接醐連接分子間的粘性末端或平末端;轉(zhuǎn):重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞,轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染;篩:雙抗生

18、重組體的篩選方法：1、根據(jù)遺傳表型篩選（抗生素抗性篩選、B-半乳糖甘酶系統(tǒng)篩

選）2、根據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特性篩選（1、快速裂解菌落并鑒定分子大小2、內(nèi)切酶酶切圖

譜鑒定3、核酸分子雜交篩選4、PCR篩選重組子5、核甘酸序列測(cè)定）

19、簡(jiǎn)述如何篩選pUC載體和目的基因形成的重組體：（1）2.69kb,保存了pBR322

質(zhì)粒的Ampr,轉(zhuǎn)化菌可在氨茶青霉素培養(yǎng)基中存活；（2）LacZ'基因編碼B-半乳糖

昔酶的一個(gè)片段，與宿主細(xì)胞編碼的缺陷型B-半乳糖普酶互補(bǔ)成為完整的酶，催化指示

劑底物X-gal形成藍(lán)色產(chǎn)物，菌落呈藍(lán)色；（3）LacZ'基因中有MCS外源基因插入，使

LacZ'基因插入失活，不能表達(dá)a-片段，不能與宿主細(xì)胞互補(bǔ)，X-ga1不能轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)

色，表現(xiàn)白色菌落。

19、連接DNA片段的方法重要有哪些？粘端連接、平端連接、定向連接、同聚物加尾連

接、人工接頭連接

20、重組體DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法重要有哪些？1、CaCI2轉(zhuǎn)化法2、電穿孔法

3、磷酸鈣共沉淀法4、入噬菌體的轉(zhuǎn)染5、脂質(zhì)體法6、顯微注射法

核酸分離與純化：1、鑒定完整性:以漠化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結(jié)果可用于判斷核

酸完整性1、完整無降解或降解很少的總RNA電泳圖，除具特性性三條帶外，三條帶的

熒光強(qiáng)度應(yīng)為一特定比值2、降解系數(shù)大的核酸條帶相對(duì)分子質(zhì)量大，電泳遷移率低，溟

化乙錠嵌入核酸中的數(shù)量也增多，熒光強(qiáng)度高;反之……3、一般28s或23SRNA的熒光

強(qiáng)度約為18s或16s的2倍，否則提醒有RNA降解，若在加樣槽附近有條帶，則DN

A有污染2、真核生物RNA18S、28s原核：23S、16s3、mRNA代表基因轉(zhuǎn)錄水

平，行使模版功能4、核酸純度鑒定：1、紫外分光光度法：最常用A：核酸在260nm

處有最大吸取峰B:蛋白質(zhì)在280nm處...C：鹽和小分子在23OnmD:酚在270nm處

5、純DNAA260/A280=1.8A260/A280=2.0高質(zhì)量RNA(1.8-2.1)A230/A2

60=0.4-0.5若升高，有殘余鹽2、熒光光度法

PCR1、PCR聚合酶鏈反映技術(shù)的原理:由人為提供模板DNA、DNA引物、4種dNTP

和DNA聚合酶，在體外條件下實(shí)現(xiàn)DNA復(fù)制的過程。

2、PCR用途：目的基因克隆、基因體外突變、DNA和RNA的微量分析、DNA序列測(cè)

定、基因突變分析

3、PCR三個(gè)基本環(huán)節(jié)：變性-退火-延伸變性：93-98攝氏度退火：37-65攝延伸:

70-75攝,，整個(gè)PCR過程一般需進(jìn)行三十輪的循環(huán)，

4、退火溫度由引物的Tm值決定，延伸溫度和時(shí)間由TaqDNA酶活性決定一般變性

溫度與時(shí)間為94℃30-50s產(chǎn)物由引物決定，循環(huán)次數(shù)由初始模版濃度決定

5、變性:在第一輪循環(huán)前需預(yù)變性，在94°C下變性5-10min非常重要，它可使模板DNA

完全解鏈；退火:引物退火的溫度的高低和所需時(shí)間的長短取決于引物的堿基組成、引物

的長度、引物與模板的配對(duì)限度以及引物的濃度實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm

值約低退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高延伸:反映通常為72℃,接近于Taq

DNA聚合酶的最適反映溫度75℃

6、Tm值:DNA熱變性發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)，將DNA變性達(dá)成50%時(shí)的

溫度稱解鏈溫度或溶解溫度。GC越高，Tm值越高

7、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反映體系模板DNA0.1~2ug引物各0.l~1.0umol/L4種dNTP混

合物各200umol/LTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5—2.0mmol/L

8、產(chǎn)物不同:1、長片段產(chǎn)物以算術(shù)倍數(shù)增長在終產(chǎn)物中忽略不計(jì)2、短……:長度嚴(yán)

格定格在兩引物5*端之間，是需要擴(kuò)增的特異片段以指數(shù)倍數(shù)增長以上是PCR產(chǎn)物

不需純化的因素

9、產(chǎn)物不同因素：引物結(jié)合的模版不同

10、引物：事實(shí)上就是兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列3側(cè)，互補(bǔ)的寡核甘酸片段。擴(kuò)

增時(shí)從引物的3'端開始，以5'-3,方向延伸，兩引物的5'端決定擴(kuò)增產(chǎn)物的兩個(gè)

5’末端位置，兩引物間距離決定擴(kuò)增片段的長度。

II、引物設(shè)計(jì)的必要條件是與引物互補(bǔ)的靶DNA序列必須是已知的

12、引物設(shè)計(jì)有3條基本原則:1、引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)；2、引物與引物之間避

免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)3、引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反映

（即錯(cuò)配）

13、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法：1.凝膠電泳重要有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電

泳瓊……最常用最經(jīng)典可判斷產(chǎn)物大小2、限制性內(nèi)切酶酶切分析RFLP若知道PCR

擴(kuò)增片段的序列或限制性內(nèi)切酶酶切圖譜，則可選擇合適的限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，

再進(jìn)行電泳分析，根據(jù)PCR酶切產(chǎn)物的電泳圖譜，可鑒定PCR產(chǎn)物的特異性及是否存在

突變。用于檢測(cè)基因突變3、分子雜交為了擬定PCR產(chǎn)物是否是預(yù)先設(shè)計(jì)的目的片

段或產(chǎn)物是否有突變點(diǎn)雜交、Southern印跡雜交點(diǎn)雜交靈敏度較高,特別合用于特

異性不高的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析。用于檢測(cè)基因突變，常規(guī)的southern印跡雜交可

鑒定PCR產(chǎn)物的大小和特異性4、酶檢測(cè)PCR法一方面對(duì)PCR反映的引物5'端進(jìn)行

修飾，一個(gè)引物的5'端攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基因，如生物素等,另一個(gè)引物的

5'端具有便于酶聯(lián)顯色檢測(cè)的基團(tuán)，如酶或抗原、抗體等。通過包被于微孔板中的基團(tuán)

如親和素，將PCR產(chǎn)物固定于微孔板上，進(jìn)行酶聯(lián)顯色，比色測(cè)定合用于檢測(cè)引物5'

端修飾的PCR產(chǎn)物比電泳檢測(cè)靈敏度高,比分子雜交法簡(jiǎn)便。5、測(cè)序PCR產(chǎn)物直接

進(jìn)行測(cè)序分析可檢測(cè)基因突變是檢測(cè)其特異性的最可靠方法

14、RFLP限制性內(nèi)切酶酶切分析：由于基因突變導(dǎo)致某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)序

列產(chǎn)生或消失，經(jīng)電泳分離出大小不同的片段。

15、提高PCR的特異性和敏感性1.熱啟動(dòng)PCR:一種在冰上配制PCR反映液，并將其置

于預(yù)熱的PCR儀,通過克制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)成變性溫

度。2、梯度PCR：復(fù)性溫度高低決定擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物高低選定一個(gè)復(fù)性溫度范

圍，跨越引物Tm值10~20℃。初期循環(huán)，復(fù)性時(shí)從高溫開始，逐漸減少復(fù)性溫度，直至最

低復(fù)性溫度3、巢式PCR(nestedPCR)嵌套式PCR:用2對(duì)引物進(jìn)行2次PCR

來擴(kuò)增目的基因第一次PCR：一對(duì)外側(cè)引物第二次PCR：一對(duì)內(nèi)側(cè)引物4、免疫PCR：

酶檢測(cè)PCR法通過免疫酶反映+PCR來進(jìn)一步提高敏感性和特異性

16、多重PCR:它是在同一PCR反映體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片

段的PCR反映,其反映原理，反映試劑和操作過程與一般PCR相同

17、不對(duì)稱PCR：目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法:采用兩種不同濃度的

引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是0.01：0.5M,關(guān)鍵是

限制性引物的絕對(duì)量。用途:制備核酸序列測(cè)定的模板、制備雜交探針、基因組DNA結(jié)

構(gòu)功能的研究

18、反向PCR:目的：在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)未知DNA序列

19、任意引物PCR：AP-PCR區(qū)分不同種的菌株、種內(nèi)不同血清型、血清型內(nèi)不同

亞型。作用：判斷相同種的不同分離株是否有流行病學(xué)上的相關(guān)性

20、重組PCR:運(yùn)用PCR技術(shù)，使兩個(gè)不相鄰的DNA片段重組在一起的方法，稱重

組PCR目的：①使2個(gè)不同來源的DNA片段重組；②構(gòu)建基因突變體如點(diǎn)突

變、缺失、插入等。

21、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR):RNA分子為模板進(jìn)行的擴(kuò)增，以其一方面要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄

產(chǎn)生cDNA,然后進(jìn)行常規(guī)的PCR反映關(guān)鍵環(huán)節(jié)是RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,cDNA

進(jìn)行PCR與一般由PCR無差別。

22、熒光定量PCR(FQ-PCR)又稱實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR):非探針類PCR,通過對(duì)熒光信號(hào)

的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR過程中產(chǎn)物量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并精確地計(jì)算出PCR的初始模板量

23、熒光定量PCR技術(shù)在HBV檢測(cè)中的應(yīng)用：HBV感染的初期診斷、監(jiān)測(cè)治療

效果、判斷病情,指導(dǎo)制定合理的治療方案、在乙肝病毒耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用、血液制品和

鮮血員的篩選,隱匿性肝炎的發(fā)現(xiàn)、HBV-DNA定量有助于指導(dǎo)懷孕，減少宮內(nèi)感染的

發(fā)生率、篩選肝炎的質(zhì)量藥物

24、水解探針:Taqman探針:PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光

探針。該探針為一直線型的寡核甘酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基

團(tuán)，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸取，PCR儀檢測(cè)不到熒光信

號(hào)，PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段）Taq酶的5'-3，外切酶活性將探針酶切降解，使

報(bào)告熒光基團(tuán)，和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而英光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接受到熒光信號(hào)

25、Beacon技術(shù):即分子燈塔法或分子信標(biāo)技術(shù)：?jiǎn)捂湽押烁仕釤晒馓结?，在無靶序列的

情況下，探針始終是發(fā)卡結(jié)構(gòu)，報(bào)告基團(tuán)的熒光被猝滅基團(tuán)猝滅，使熒光檢測(cè)儀檢測(cè)不到

熒光信號(hào);而在有靶序列時(shí)，即在PCR的退火階段探針與靶序列結(jié)合，使熒光報(bào)告基團(tuán)和

猝滅基團(tuán)分開，這樣熒光儀可以檢測(cè)到熒光，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱代表了靶序列的多少。

26、FRET技術(shù)：基本原理是:兩條直線型寡核甘酸探針，其中一條的3'端標(biāo)記熒光激發(fā)基

團(tuán)，另一條的5'端標(biāo)記熒光檢測(cè)基團(tuán)，在無靶序列的情況下，兩條探針分開，無法進(jìn)行

能量的傳遞，這樣熒光儀不能檢測(cè)到熒光信號(hào)，當(dāng)有靶序列時(shí)，即在PCR的退火階段兩條

探針與靶序列結(jié)合，使得兩條探針上的熒光基團(tuán)可以進(jìn)行能量的傳遞，這樣熒光儀就可以

檢測(cè)到熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱代表了靶序列的多少。所以對(duì)該信號(hào)的檢測(cè)是在退火后

進(jìn)行

27、Sanger定義：以靶DNA鏈為模板，指導(dǎo)核酸合成的過程中，以釋放熒光為檢測(cè)

信號(hào)，從而對(duì)靶DNA鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)序的方法原理:運(yùn)用DNA聚合酶，以單鏈DNA為

模板，以dNTP為底物，在四組相對(duì)獨(dú)立的反映體系中分別加入不同的ddNTP作為鏈反映

終止劑，根據(jù)堿基配對(duì)原則，在測(cè)序引物引導(dǎo)下，合成四組有序梯度的互補(bǔ)DNA鏈，然

后通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后直接識(shí)度待測(cè)DNA

的序列

28、如何來擬定模板DNA的量？當(dāng)固定C循環(huán)數(shù)后,熒光信號(hào)與模板數(shù)成正比；當(dāng)固定

t熒光信號(hào)值后，模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)成反比。每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)

的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小運(yùn)用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)

曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值只要獲得未知樣品的Ct值,

即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

29、Ct值的含義是：每個(gè)反映管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值

分析事實(shí)上就是低濃度的熒光值分析

30、熒光域值：是指PCR反映的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)

31、RNA的體外擴(kuò)增NASBA：核酸序列的擴(kuò)增NASBA、轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)TA

S、自主維持序列擴(kuò)增或再生式序列復(fù)制3SR

32、基本原理:以RNA為模板在體外大量擴(kuò)增RNA,運(yùn)用3種酶:逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚

合酶和RNaseH,模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒RNAgenome的復(fù)制過程，來大量擴(kuò)增RNA。反

映體系溫度均一at42℃、RNA產(chǎn)物以10的指數(shù)方式增長

33、2個(gè)特殊引物:引物A—與RNA3（端互補(bǔ)，5'端含T7啟動(dòng)子引物B-與cD

NA第一條鏈3'端互補(bǔ)

34、連接酶鏈反映LCR基本原理：是以DNA連接酶將某一DNA鏈的5'磷酸與另一

相鄰鏈的3'羥基連接為基礎(chǔ)的循環(huán)反映。

1、遺傳性疾病的分子診斷策略和方法？遺傳性疾病分兩類:符合孟德爾遺傳規(guī)律的單基因

遺傳病、不符合孟德爾遺傳規(guī)律的多基因遺傳?。ㄓ址Q多因素性疾病）

2、三代遺傳標(biāo)志1.RFLP2.STR,VNTR3.SNP

2、遺傳病的分子診斷：1、血紅蛋白病:血紅蛋白病可以分為①由于珠蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

所導(dǎo)致的異常血紅蛋白??；②由于珠蛋白多肽鏈的合成速率不平衡所導(dǎo)致的地中海貧血

2、鐮狀細(xì)胞貧血:一種遺傳性貧血癥，屬隱性遺傳性疾病。患者的紅細(xì)胞缺氧時(shí)變成鐮刀

形，失去輸氧的功能,破裂導(dǎo)致嚴(yán)重貧血。該病常見于非洲和美洲黑人，由于雜合基因型細(xì)

胞貧血癥狀輕微，但紅血球內(nèi)的輕微缺氧對(duì)寄生在紅血球里的瘧原蟲卻是致死的，有助于

防止瘧疾的流行限制性內(nèi)切酶Mstll辨認(rèn)序列為CCTNAGG,N為任意核昔酸。因此

P珠蛋白基因的第5、6、7密碼子中有該內(nèi)切酶的辨認(rèn)位點(diǎn)。發(fā)生鐮狀突變后該酶

切位點(diǎn)消失

3、地中海貧血：是由于珠蛋白鏈的合成不平衡所導(dǎo)致的一類常見的單基因遺傳性、溶血

性疾病A:PCR法、Southem印跡法、B：PCR-RDB法、PCR-AS0法、等位

基因特異性PCR(ASPCR)、芯片技術(shù)

3、產(chǎn)前遺傳缺陷的分子診斷:產(chǎn)前診斷PND、植入前遺傳學(xué)診斷PGD:PND和PGD

的適應(yīng)癥：PND：(通過對(duì)絨毛組織或羊水細(xì)胞的基因分析，可診斷100多種單基因

遺傳病。PGD:采用極體分析法對(duì)30多種遺傳病進(jìn)行診斷。)A.有也許孕育出嚴(yán)重遺

傳性疾病和先天性畸形胎兒的孕婦。B.夫婦一方有某種遺傳病或曾生出過某種遺傳病患

兒，或孕婦有X伴性隱性遺傳病家族史。C.夫婦任何一方為染色體異常、染色體平衡移

位和倒位攜帶者。D.早孕階段曾服用過致畸藥物或曾有病毒感染史等致畸情況。E.羊水

過多或過少。F.因素不明的多次流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)的孕婦。G.胎兒發(fā)育遲緩。H.未觸到

正常的胎兒。I.年齡超過35歲的孕婦等等

4、腫瘤細(xì)胞增生的分子機(jī)制：原癌基因活化或抑癌基因失活;促凋亡基因失活或克制凋亡

基因功能增強(qiáng);DNA修復(fù)基因失活

5、家族性高脂血癥的分子診斷表型分類基因缺陷臨床特性家族性高膽固醇血癥LDL

受體