四川大學(xué)-生物技術(shù)-綜合實驗報告-學(xué)生版

.⑨SDSLoadingBuffer；儀器電泳儀、染液缸實驗方法E.coliBL21<DE3>感受態(tài)的制備；重組子轉(zhuǎn)化BL21；原核表達1挑取上述方法得到的單菌落于2mLLB液體培養(yǎng)基<氨芐青霉素50μg/mL>中。同時,BL21作為對照〔不加抗生素。于37℃培養(yǎng)至OD600為0.5；2取20μL菌液接種2mLLB液體培養(yǎng)基<氨芐青霉素50μg/mL>,37℃培養(yǎng)OD600為0.5；3加入IPTG最終濃度梯度2mM,18℃誘導(dǎo)表達16h；4誘導(dǎo)結(jié)束后,用超聲波破碎細胞；51mL菌液加入100μL的SDSLoadingBuffer,100℃煮沸5min；6取30μL上清樣品點樣,分析SDS膠,觀察表達結(jié)果；4.按下表配方制備SDS凝膠,加樣。先10mA恒流電泳至分離膠,再調(diào)為15mA恒流到電泳結(jié)束；組分12%分離膠<mL>3.9%濃縮膠<mL>丙烯酰胺貯液4×Tris·Cl/SDS,pH8.84×Tris·Cl/SDS,pH6.8ddH2O10%過硫酸銨TEMED6.003.75--5.250.050.010.65--1.253.050.0250.0055.考馬斯亮藍染色將聚丙烯酰胺凝膠用固定液固定2h；傾去固定液,以考馬斯亮藍染色液染色4h；傾去染色液,加入脫色液,緩慢搖動脫色。中間換脫色液,脫色到獲得藍色條帶及干凈的背景為宜。實驗結(jié)果1.重組子轉(zhuǎn)化的E.coliBL21<DE3>篩選鑒定通過兩輪氨芐青霉素〔50μg/mL篩選成功轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的受體菌BL21后,37℃培養(yǎng)至OD600為0.5,此時培養(yǎng)皿中呈大量灰白色帶菌絲菌落,此處未用圖片記錄；隨后重新轉(zhuǎn)化搖菌,培養(yǎng)皿出現(xiàn)正常BL21菌落。2.誘導(dǎo)表達產(chǎn)物電泳檢測如圖1.其中編號1為Marker,2b為本實驗小組電泳條帶,紅色方框圈出部分為γ-GCS蛋白,可見十分明亮的單一條帶,但邊緣處稍顯彌散不夠整齊。另亮條帶下方仍有少許顏色較淺的雜質(zhì)帶,拖尾現(xiàn)象明顯。圖1.γ-GCS產(chǎn)物電泳圖。1為Marker,2b為本小組電泳帶,紅色方框圈出γ-GCS產(chǎn)物條帶,含量較高。另外,針對圖1.對照組方面的缺陷,本實驗還增加了如圖2.改進。其中,紅色方框圈出部分為IPTG誘導(dǎo)γ-gcs表達產(chǎn)物的電泳條帶,9泳道加入了有IPTG誘導(dǎo)的pET32質(zhì)粒,用以確定空質(zhì)粒不表達γ-GCS,且條帶較深處位于下方,說明多含小分子蛋白。8、9泳道均以單一變量原則設(shè)置為空白對照,若缺少IPTG的強誘導(dǎo)作用,目標(biāo)蛋白γ-GCS的產(chǎn)量也會大大減少。123456789圖2：1、2、3、4、5、6、7道：IPTG誘導(dǎo)的γ-GCS表達,已由紅色方框圈出；8道：未加入IPTG誘導(dǎo)的γ-GCS表達；9道：pET32質(zhì)粒加入IPTG誘導(dǎo)表達。分析與討論1.重組子轉(zhuǎn)化的篩選結(jié)果因第一次涂布后出現(xiàn)大量灰白色帶菌絲菌落,而一般E.Coli菌落應(yīng)呈圓形、邊緣整齊且表面光滑的半透明小凸起,由此推測可能是培養(yǎng)基被霉菌污染所致,需重新進行涂布培養(yǎng),PH達7.4最佳。2.γ-GCS電泳檢測結(jié)果如圖1.最明亮的條帶應(yīng)該是IPTG誘導(dǎo)目的基因所表達的產(chǎn)物γ-GCS,由于進行陽性重組質(zhì)粒篩選后BL21攜帶大量目的基因γ-gcs,在IPTG誘導(dǎo)的情況下lac強啟動子因阻遏蛋白失活而啟動轉(zhuǎn)錄,位于其下游的γ-gcs得以表達,從圖1.2b可知該實驗較為成功。另外,雜質(zhì)蛋白的出現(xiàn)經(jīng)分析可能與BL21表達源性蛋白有關(guān),也可能是LB培養(yǎng)基里的蛋白質(zhì)有少許混入樣品所致,但由于目的基因表達量較高,雜質(zhì)對其影響不大。若需要更充分證明產(chǎn)物γ-GCS,可在pET-32aXhoI酶切位點后加入6個His標(biāo)簽,進一步通過His特異性抗體做Western雜交驗證產(chǎn)物的表達,此方法對目的基因表達量很少時較適用?？偨Y(jié)整個實驗到此基本完結(jié),從提取RNA、進行反轉(zhuǎn)錄得cDNA并驗證、又由cDNA擴增出γ-gcs、連接質(zhì)粒pET-32a后轉(zhuǎn)入BL21誘導(dǎo)其表達,到最終得產(chǎn)物γ-GCS,共分五個實驗,將真核生物基因克隆及表達產(chǎn)物的全過程分步介紹,且使我們對之有了具體理解和體會。但最后因失誤忘記錄蛋白質(zhì)Marker、γ-GCS的分子量大