《實驗動物 病原核酸液相芯片法定性分析》

1DB/XXXXX—2021實驗動物病原核酸液相芯片法定性分析本文件規(guī)定了實驗動物病原核酸的液相芯片定性分析方法。本文件適用于基于液相芯片方法的實驗動物病原核酸的定性分析。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適合于本文件。3.1液相芯片技術(shù)（suspensionarraytechnology）液相芯片技術(shù)又被稱為懸浮陣列、流式熒光術(shù)、xMAP技術(shù)等。它是在不同熒光編碼的微球上進行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，通過紅、綠兩束激光分別識別微球編碼和報告熒光來達到定性和定量的目的，一個反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達100種不同的生物學反應(yīng)，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量多分子分析技術(shù)平臺。4縮略語下列縮略語適用于本文件。cDNA互補DNA（complementaryDNA）CPE細胞病變效應(yīng)（cytopathiceffect）DEPC焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）DNA脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）MFI中位熒光強度值（medianfluorescenceintensity）PBS磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）PCR聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction）RNA核糖核酸（ribonucleicacid）SA-PE鏈霉親和素-藻紅蛋白（streptavidinR-phycoerythrin）2DB/XXXXX—2021xMAP多分子分析技術(shù)（flexiblemulti-analyteprofilingtechnology）5原理本文件方法的核酸擴增原理是基于每種病原微生物都可通過特異性的PCR引物來進行核酸擴增，在每種特定目的片段的擴增引物5′端與對應(yīng)的標簽（TAG）序列的3′端通過間臂連接，另一條原始引物的5′端添加生物素標記；這樣所擴增的基因片段既帶有TAG標簽，也帶有生物素標記，以供后期的液相芯片特異性識別目標分子。本文件方法的液相芯片檢測原理是采用2種熒光染料對直徑約為5.6μmol/L帶磁性聚苯乙烯小球（以下簡稱微球）進行著色，通過不同混合比例產(chǎn)生100種不同配比的顏色，每一種顏色賦予唯一編碼，通過編碼識別染色的微球。這些熒光微球表面帶有羧基基團（如羧基、親和素和組氨酸等）可共鍵結(jié)合（或稱偶聯(lián)）不同類型的探針（如抗原、抗體、寡核苷酸探針等），形成帶標記的熒光微球。待測樣本（如蛋白、核酸等）以生物素標記，再與結(jié)合了探針的熒光微球進行特異性結(jié)合反應(yīng)，生物素標記與添加到反應(yīng)體系中的以PE熒光染料標記的鏈霉親和素（Streptavidin）或稱SA-PE發(fā)生連接可實現(xiàn)熒光信號的放大。因此，整個反應(yīng)結(jié)束后形成的陽性復合物可檢測到微球的熒光和SA-PE的熒光信號。液相芯片檢測儀工作時，上述復合物在液流系統(tǒng)中快速通過，第一束紅色激光識別微球染料和編碼，第二束綠色激光讀取SA-PE熒光信號的強弱，儀器將獲取到的兩種光信號進行快速處理并形成數(shù)字信號，經(jīng)軟件分析后計算得到每一種待測樣本的含量。因此，液相芯片技術(shù)是集流式細胞技術(shù)、熒光標記微球、激光、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)的生化技術(shù)于一體，可以實現(xiàn)快速高通量多分子定性及定量分析的技術(shù)。6主要設(shè)備和材料6.1液相芯片檢測儀。6.2PCR儀。6.3全自動核酸提取儀。6.4超聲波儀。6.5高速冷凍離心機。6.6普通離心機。6.7漩渦振蕩器。6.8組織勻漿器。6.9生物安全柜。6.10PCR超凈工作臺。6.11冰箱（-20℃)。6.12微量移液器（0.1μL～2μL，1μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL）。6.13滅菌離心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），滅菌吸頭（10μL，200μL，1mL），滅菌PCR擴增反應(yīng)管（0.2mL，八連管或96孔板）。聚乙烯薄膜袋：90mm×150mm自封袋，使用前紫外滅菌20min。6.14采樣工具：剪刀、鑷子和滅菌棉拭子等。7試劑7.1以下所用的試劑除特別注明者外均為分析純，實驗用水為雙蒸水或去離子水，應(yīng)符合GB/T6682所規(guī)定一級水的要求。所有涉及分子生物學操作的水均為無DNA酶、無RNA酶水。3DB/XXXXX—20217.2表面帶有羧基的特定編碼微球（濃度為1.25×107beads/mL）。7.3滅菌PBS。配制方法見附錄A。7.4PCR用水：經(jīng)DEPC處理的水或商品無DNA酶、無RNA酶水，見附錄A。7.5核酸抽提試劑：推薦針對不同的樣本基質(zhì)類型和不同病原微生物的核酸類型選取不同的基因組提取試劑盒。7.6反轉(zhuǎn)錄試劑：PrimeScriptRTreagentKit或其他類似產(chǎn)品。7.7PCR試劑：QIAGENMultiplexPCRPlusKit或其他類似產(chǎn)品。注：QIAGENMultiplexPCRPlusKit是本文件中7.8SA-PE反應(yīng)液（1mg/mL）。7.91×TM雜交緩沖液，配制見附錄A。7.10引物：各病原微生物特異性正向引物的5′端與對應(yīng)的TAG序列的3′端通過間臂（Spacer）連接修飾，特異性反向引物5′端標記生物素（biotin所有的引物合成后均需要進行色譜級（HPLC）純化。8方法8.1生物安全措施對于可能潛在人獸共患病的樣本，應(yīng)在生物安全二級及以上實驗室進行操作，采樣應(yīng)在生物安全柜中進行。采樣結(jié)束，動物尸體及采樣器材應(yīng)高壓滅菌后處理。實驗操作及處理按照GB19489的規(guī)定，由具備相關(guān)資質(zhì)的工作人員進行相應(yīng)操作。8.2采樣及樣本的處理采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣及樣本前處理過程中須戴一次性手套。采樣及樣本處理過程操作人員應(yīng)做好個人防護。8.2.1臟器組織剖檢，無菌采集動物臟器組織，剪取待檢樣本0.5g～2.0g于無菌離心管，加入5倍體積滅菌PBS，使用勻漿器充分勻漿1min～2min，然后將組織懸液在4℃,5000g離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌離心管中，編號備用。8.2.2盲腸內(nèi)容物或糞便無菌采集動物盲腸內(nèi)容物或糞便，取待檢樣本1.0g～2.0g于無菌5mL離心管，加入5倍體積滅菌PBS，使用勻漿器充分勻漿1min～2min，8000g離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號備用。8.2.3血液樣本無菌采集動物血液0.2mL～0.5mL，加入檸檬酸鈉或EDTA抗凝管中，輕輕顛倒混勻3次～5次，編號備用。8.2.4拭子取樣4DB/XXXXX—2021對活體動物取樣可采集肛拭子、咽喉拭子、泄殖腔拭子、鼻拭子、皮膚拭子等，浸泡3mL無菌PBS中，5min～10min，充分混勻后，4℃,8000g離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號備用。8.2.5細胞培養(yǎng)物應(yīng)通過以下任一方法取樣：——直接刮取樣本接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細胞培養(yǎng)物于15mL離心管中，1500g離心5min，棄上清，加1mL滅菌PBS重懸細胞，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌1.5mL離心管中，編號備用；——將樣本接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細胞培養(yǎng)物反復凍融3次，細胞混懸液轉(zhuǎn)移于15mL離心管中，8000g離心5min，去細胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到無菌15mL離心管中，編號備用。8.2.6細菌分離培養(yǎng)物經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)的固體菌落或液體培養(yǎng)物，或待鑒定的純化培養(yǎng)物，取適量樣本裝于無菌1.5mL離心管中，編號備用。8.2.7飼料、墊料和飲水飼料、墊料：取約5g～10g飼料和墊料置于50mL無菌離心管中，加入3倍體積滅菌PBS（飼料和墊料需全部浸泡于液體中）。密封后浸泡5min～10min，充分混勻，將混懸液轉(zhuǎn)移至15mL無菌離心管，4℃,8000g離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號備用。飲水：取200μL～1000μL實驗動物飲水直接轉(zhuǎn)移到無菌1.5mL離心管中，編號備用。8.2.8設(shè)施設(shè)備用滅菌棉拭子拭取實驗動物設(shè)施設(shè)備出風口初效濾膜表面約5cm2沉積物，將拭子置入滅菌15mL離心管，加入3mL滅菌PBS，浸泡5min～10min，充分混勻，取出棉拭子，將離心管于4℃,8000g離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號備用。8.2.9樣本的存放采集或處理的樣本在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h，若需長期保存，須放置于-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復凍融。8.2.10采樣廢棄物處理采樣結(jié)束，動物尸體應(yīng)使用生物安全垃圾袋包裝完整，高壓滅菌后交由醫(yī)療垃圾處理單位進行處理，采樣器材應(yīng)使用消毒液浸泡或高壓滅菌消毒，并做好實驗臺面及采樣室的消毒。8.3樣本核酸提取8.3.1在核酸提取區(qū)操作，采用DNA或RNA提取商業(yè)試劑盒或其他類似試劑盒。8.3.2取n個滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性對照+陰性對照，對每個離心管進行編號，按試劑盒操作說明書進行。8.3.3提取好的DNA在2℃~8℃冰箱可保存一月，-20℃冰柜可穩(wěn)定保存兩年；提取好的RNA應(yīng)盡快進行下一步PCR反應(yīng)，若暫時不能進行PCR反應(yīng)，應(yīng)于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.4核酸擴增5DB/XXXXX—20218.4.1反轉(zhuǎn)錄（可選）根據(jù)不同病原微生物的核酸類型選擇是否進行反轉(zhuǎn)錄，DNA病毒和病原菌可直接進行PCR擴增。在PCR溶液配制區(qū)操作，RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表1。反應(yīng)液的配制在冰上操作，反應(yīng)條件為37℃25min；85℃5s。反應(yīng)產(chǎn)物即為cDNA，立即進行下一步PCR反應(yīng)，若不能立即進行PCR，cDNA保存溫度不能低于-20℃。長時間保藏應(yīng)置于-80℃冰箱。10μL反應(yīng)體系可最大使用500ng的TotalRNA。表1RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系2PrimeScriptRTEnzym5注：可使用其他類似的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行，反應(yīng)體系和8.4.2PCRPCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)液的配制在冰浴上操作，每次反應(yīng)同時設(shè)計陽性對照、陰性對照和空白對照，其中陽性對照以含有目的病原微生物的組織或培養(yǎng)物提取的核酸作為陽性對照模板，其中陰性對照以不含有目的病原微生物（可以是正常動物組織或正常培養(yǎng)物）作為陰性對照模板，空白對照即為不加模板對照（NoTemplateControl，NTC即在反應(yīng)中用水來代替模板。表2PCR反應(yīng)體系配制表244PCR反應(yīng)參數(shù)PCR反應(yīng)參數(shù)見表3。6DB/XXXXX—2021表3PCR反應(yīng)參數(shù)11注：可使用其他類似的一步法或兩步法RT-PCR試劑盒進行，反應(yīng)體系和8.5PCR產(chǎn)物雜交8.5.1所有試劑恢復到室溫，所有的操作均應(yīng)避光，可選用不透明離心管或用鋁鉑膜包裹遮光的離心管進行操作。8.5.2取出裝有偶聯(lián)好探針微球的貯存管，于旋渦震蕩器上震蕩，再用40khz超聲波儀處理20s，使微球充分分散。8.5.3熒光編碼微球工作液的制備：將2500個/μL熒光編碼微球用1×TmHybrdizationBuffer稀釋到1μL約含有125個/種熒光編碼微球。8.5.4SA-PE工作液制備：將1mg/mLSA-PE用1×TmHybrdizationBuffer稀釋到10μg/μL。8.5.5充分重懸熒光編碼微球工作液，每個樣品孔和對照孔加入微球工作液20μL，隨后樣品孔中加入5μLPCR產(chǎn)物，對照孔中也分別加入5μLPCR陽性對照、陰性對照和空白對照產(chǎn)物，最后加入75μL的SA-PE工作液，充分混勻，于金屬加熱器中37℃~45℃孵育25min～45min。8.6液相芯片檢測儀讀取熒光8.6.1在PCR擴增進行時，打開液相芯片檢測所有相關(guān)儀器，并將儀器的上樣加熱底板預(yù)先加熱至8.6.2按照液相芯片檢測儀操作說明書，進行各個參數(shù)的設(shè)置。8.6.3每個樣品上機時，應(yīng)同時選擇特定編碼微球，并填寫每種熒光微球?qū)?yīng)病原微生物名稱。8.6.4檢測體積為75μL，流速為快速，每種熒光微球設(shè)置計數(shù)為至少50個，計數(shù)時間為60s。8.6.5取出雜交好的待檢樣本放入液相芯片檢測儀，并在軟件界面進行相應(yīng)的標注。開啟檢測。8.6.6同一批樣品建議在30min內(nèi)讀取數(shù)據(jù)完畢。9結(jié)果9.1數(shù)據(jù)有效性分析每種特定編碼微球個數(shù)不少于50個，空白對照熒光強度不高于100，陰性對照熒光強度不高于200，陽性對照與自身對應(yīng)寡核苷酸探針特異性雜交熒光強度高于空白對照五倍以上。9.2結(jié)果計算液相芯片定性比值結(jié)果（Luminexqualitativeratioresult，LQRR）等于樣品校正后的熒光強度中位值（Medianflorescenceintensity，MFI）與空白對照MFI的平均值（MFIB）的比值，見公式（1）。7DB/XXXXX—2021LQRR=MFI/MFIB……（1）式中：LQRR—液相芯片定性比值MFI—檢測樣品熒光強度中位值MFIB—空白對照熒光強度中位值儀器檢測后，自帶的數(shù)據(jù)分析軟件自動按上述公式進行計算，直接輸出結(jié)果。9.3結(jié)果分析與定性判定9.3.1關(guān)聯(lián)某種病原微生物的特定編碼微球在液相芯片檢測儀中獲得的數(shù)值如LQRR≥3，判定該樣本為該種病原微生物核酸檢測結(jié)果陽性。9.3.2關(guān)聯(lián)某種病原微生物的特定編碼微球在液相芯片檢測儀中獲得的數(shù)值如LQRR<2，判定該樣本為該種病原微生物核酸檢測結(jié)果陰性。9.3.3關(guān)聯(lián)某種病原微生物的特定編碼微球在液相芯片檢測儀中獲得的數(shù)值如2≤LQRR<3，判定該樣本為該種病原微生物核酸檢測結(jié)果可疑?？梢蓸悠窇?yīng)重新進行試驗，如結(jié)果值仍介于此區(qū)間，則判定為陰性。10防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的要求執(zhí)行。8DB/XXXXX—2021（規(guī)范性）溶液的配制A.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制A.1.1A液0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H20）27.6g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.2B液0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉NaH2PO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g），先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.30.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制取A液14mL，B液36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g，加800mL無離子水溶解稀釋，用HCl調(diào)pH至7.2，最后定容至1000mL，經(jīng)121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.2無RNase去離子水的配制實驗用去離子水按體積比0.1%加入DEPC搖勻，室溫靜置過夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.31×TM雜交緩沖液NaCl0.2mol/LTris0.1mol/LTritonX-1000.08%調(diào)pH至8.0過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?DB/XXXXX—2021（資料性）實驗動物病原液相基因芯片引物針對實驗動物大、小鼠、猴、兔、禽類病原保守核酸序列設(shè)計液相基因芯片特異引物組合。表B.1大小鼠病原液相基因芯片引物列表TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-spacer18-GATCTAAGTYAACCBio-GAAGGAAGGGGCAACACCACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-TGGMATCCTCAAGAAGABio-ATGCCMGAAAACCARGAGTATACTTCTTTACTACAATTTACAAC-spacer18-TCTGTYCTGCGCTBio-GCTGCGCCATCACTCACACTACACATTTATCATAACAAAT-spacer18-CCTCGCCTACGTGAABio-CATCATCGAGTCCCTGGTACTACTTCTATAACTCACTTAAA-spacer18-TTGTTCCACCACCACBio-GGTTTGTGTTCAAGATCTAGACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-CACCAGCAACAGACAACCBio-TGAATGCGTTGAGTGTTAATAACAACTCACTATATCATAAC-spacer18-GAGTCCAGAAGCTTTCTGATGTCBio-CAAGTATTCACACGGCATGATACTTTACAAACAAATAACACAC-spacer18-GGACACAATCAATGGGGATACABio-CCATATCATCCCCTAAGTGBio-TCCACAACTTTTGTGACAGGAATCTCAATTACAATAACACACAAA-spacer18-GATCACAGAGCCCGTCAAABio-CATATAACATCCAATACGAGTTTAATAACAACTCACTATATCATAAC-spacer18-ATCAAGCACGATTTGGABio-GATTCAGTTCGCAATGTAAGDB/XXXXX—2021表B.1大小鼠病原液相基因芯片引物列表（續(xù)）TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-spacer18-AGCGTTTGCTTCACBio-GGGCATTTCCTCCCTAACACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-TACGGTGTATATGGCBio-ACTGCTGCTTCCTATACTTAAACAATCTACTATTCAATCAC-spacer18-AGACTCACACTGCGTABio-CCAGAACTCGGTTATCCCTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-spacer18-GCCCTCTTCATCCCBio-GACCTCCATGTCCTTCAACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-CCATGCTCCCTTCTATGCGBio-TCAGTCAGCCATAGATGCACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-TGGMATCCTCAAGAAGABio-ATGCCMGAAAACCARGAGTAACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-GGAAACTTAGAGCAGACATBio-TCCACAGAGAACAACCATACTTCTTTACTACAATTTACAAC-Spacer18-ACACCATGCCAACTGBio-ATTGTTCACTCCCTGTGTTTGTAATAACAACTCACTATATCATAAC-Spacer18-GATGATAAGCGGTTCAGBio-AAGAGCTCCGGTATCTCTCTAAACATACAAATACACATTTCA-Spacer18-CTCTAGCAACTCTGBio-CAGTTATTCCTTGGAGGATTAAACAACTCTTAACTACACAA-Spacer18-AACCAGACGCTGGAATCGCTBio-TGTAGCAGTCTAGATGCAATTAAACAACTCTTAACTACACAA-spacer18-CGCAGAATCGCAAATACBio-TAACAATAAGCTCGCAGDB/XXXXX—2021表B.2兔病原液相基因芯片引物列表CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-spacer18-CTCTCCACAAAATAACCCABio-CCAACCCTGGTCCAATCTACTACTTCTATAACTCACTTAAA-spacer18-ATGGTTCGCTTGTGTCTBio-ATGCGTTGGGTGTAGTTCCTCTAAACATACAAATACACATTTCA-spacer18-TGACAACAAACGGAGTACCATAGGTCCAAACAGCCAT表B.3猴病原液相基因芯片引物列表CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-ACGACCCGGCGGAAAGABio-TGCACCAGATGACGCAGACTTAAACAATCTACTATTCAATCAC-spacer18-GTGCCAATCATGGABio-TCCTGGAGCGTCGATTAGAACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spac