藏藥鐮形棘豆的抗炎活性及化學(xué)成分研究

藏藥鐮形棘豆的抗炎活性及化學(xué)成分研究本論文從文獻(xiàn)、生藥學(xué)、藥理、化學(xué)四個(gè)方面對(duì)藏藥鐮形棘豆進(jìn)行了研究。第一部分:文獻(xiàn)研究對(duì)棘豆屬植物的化學(xué)成分和藥理活性進(jìn)行了系統(tǒng)的文獻(xiàn)研究。目前對(duì)棘豆屬植物的化學(xué)成分的研究主要集中在小葉棘豆、小花棘豆和黃花棘豆等少數(shù)幾種上,而對(duì)民間常用、療效確切的鐮形棘豆、輪葉棘豆、砂珍棘豆等僅有少量報(bào)道或未見報(bào)道,此外對(duì)棘豆屬藥用植物的藥理作用和活性篩選研究非常缺乏、方向單一。因此,從總體上說,目前國內(nèi)外對(duì)棘豆屬植物的研究尚屬于起步階段,對(duì)其藥理作用及相關(guān)活性物質(zhì)基礎(chǔ)以及兩者的相關(guān)性等幾個(gè)方面的研究有待深入。第二部分:生藥學(xué)研究本章從性狀、顯微和理化鑒別等幾個(gè)方面對(duì)鐮形棘豆藥材進(jìn)行了生藥學(xué)研究,首次觀察并描述了其根和花等藥用部位的顯微特征;此外,還增加了鐮形棘豆藥材中生物堿和皂苷類化合物的理化鑒定方法。以上研究為鐮形棘豆藥材的準(zhǔn)確鑒定提供了依據(jù)。第三部分:藥理研究1.急性毒性LD₅₀實(shí)驗(yàn)中,給予劑量為1.2、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0g/kg的鐮形棘豆總提物（EOF,最高相當(dāng)于人常用劑量的667倍）,沒有小鼠死亡,且動(dòng)物的精神狀態(tài)和體重未出現(xiàn)異常變化,表明該藥物單次口服比較安全。2.EOF的鎮(zhèn)痛活性在醋酸扭體試驗(yàn)中,不同劑量的EOF均可使小鼠扭體次數(shù)明顯減少,其中高劑量組的效果最佳（1200mg/kg,57.2%,p＜0.001）,且顯著高于其它兩個(gè)劑量組（600mg/kg和300mg/kg,p＜0.01）;在熱板試驗(yàn)中,EOF并不能降低小鼠對(duì)熱刺激的反應(yīng)性,而陽性藥物嗎啡則可以完全抑制小鼠的反應(yīng);在福爾馬林試驗(yàn)中,EOF對(duì)由福爾馬林誘發(fā)的第一相疼痛（0～5min）并沒有產(chǎn)生明顯的影響,而對(duì)于第二相疼痛（15～30min）則發(fā)揮了非常顯著的抑制作用（p＜0.01）,最高抑制率達(dá)到40.1%（1200mg/kg）。由此可見,EOF具有良好的外周鎮(zhèn)痛作用。3.EOF的抗炎活性在小鼠耳腫脹試驗(yàn)中,低、中、高劑量的EOF可不同程度地抑制由二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹,效果顯著,其中高劑量組的抑制率達(dá)58.0%,與空白組相比差異極為顯著（p＜0.001）;在卡拉膠誘導(dǎo)的腹腔炎試驗(yàn)中,EOF可顯著抑制小鼠腹腔白細(xì)胞的遷移,最高抑制率為59.4%（1200mg/kg）,并且與空白組有極顯著差異（p＜0.001）;在慢性棉球肉芽腫試驗(yàn)?zāi)[,EOF對(duì)大鼠棉球肉芽腫模型的增生反應(yīng)具有較好的抑制作用,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,給藥劑量為1200mg/kg時(shí)（抑制率為49.2%）,其療效與吲哚美辛（抑制率為55.2%）沒有顯著差別（p＞0.05）。由此可見,EOF對(duì)急性炎癥和慢性炎癥都有較好的效果。4.鐮形棘豆抗炎活性部位篩選以TPA誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型和卡拉膠引起的小鼠腹腔炎模型為平臺(tái),對(duì)鐮形棘豆揮發(fā)油、總黃酮、總生物堿、總皂苷、總多糖等五個(gè)部位進(jìn)行抗炎活性篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn),鐮形棘豆總黃酮的抗炎效果最佳（對(duì)耳腫脹度和腹腔白細(xì)胞遷移的抑制率分別為61.1%和56.4%）,與陽性藥吲哚美辛（10mg/kg）相比沒有明顯差異。在小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)中,其抑制率超過了吲哚美辛（58.6%）,顯示了優(yōu)良的抗炎效果。此外,鐮形棘豆總生物堿也具有一定的抗炎效應(yīng),但是效果不及總黃酮和陽性藥物。5.鐮形棘豆總黃酮抗炎作用機(jī)理的初步研究在大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)中,sc卡拉膠后,模型組大鼠的血清和致炎足組織中PGE₂的含量大幅上升,經(jīng)總黃酮治療,PGE₂含量明顯降低（抑制率分別為38.2%和47.5%）,但不能在6.5h內(nèi)恢復(fù)到正常水平。在該試驗(yàn)中,模型組炎性組織和血液中的MDA含量顯著升高,經(jīng)治療后,MDA的含量雖然有所降低,但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此推測,鐮形棘豆總黃酮可能主要通過抑制COXs的活性而不是通過抑制自由基的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎活性。第四部分:化學(xué)研究1.鐮形棘豆中化學(xué)成分的系統(tǒng)分析揮發(fā)油、黃酮類、生物堿類、皂苷類和多糖類化合物在鐮形棘豆藥材中所占比例較大,是其主要的化學(xué)成分。2.供抗炎活性篩選部位的分離從鐮形棘豆藥材分離得到了總黃酮（純度為83.7%,得率為2.56%）、總皂苷（純度為68.3%,得率為0.89%）、總多糖（純度為85.5%,得率為2.26%）、揮發(fā)油（得率為1.34%）以及總生物堿（得率為1.45%）等五個(gè)供抗炎活性篩選的部位。3.單體化合物分離與鑒定利用常壓硅膠柱層析法和半制備HPLC對(duì)鐮形棘豆乙醇提取物的石油醚、氯仿和乙酸乙酯三個(gè)萃取部位的化學(xué)成分進(jìn)行分離和純化,共計(jì)得到單體化合物33個(gè),通過理化方法和UV、MS和NMR等波譜方法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,鑒定了其中的30個(gè)化合物,分別為正二十九烷（A₁,n-nonacosane）、花生酸（A₂,eicosanoicacid）、β-谷甾醇（A₃,β-sitosterol）、球松素（B₄,pinostrobin）、2’,4’-二羥基二氫查兒酮（B₅,2’,4’-dihydroxydihydrochalcone）、2’,4’-二羥基查兒酮（B₆,2’,4’-dihydroxychalcone）、喬松素（B₇,pinocembdn）、豆甾醇（B₈,stigmasterol）、2’-羥基-4’-甲氧基查兒酮（B₉,2’-hydroxy-4’-methoxychalcone）、7-羥基二氫黃酮(B₁₀/C₁₉,7-hydroxyflavonone)、ψ-贗靛素(B₁₂,ψ-baptigenin)、芒柄花素(B₁₃,formononetin)、甘草素(B₁₄,liquiritigenin)、2’-甲氧基-4’-羥基查兒酮(B₁₅,2’-methoxy-4’-hydroxychalcone)、白楊素(C₁₆,chrysin)、染料木素(C₁₇,genistein)、芹菜素(C₁₈,apigenin)、2’,4-二羥基-4’-甲氧基查兒酮(C₂₀,2’,4-dihydroxy-4’-methoxychalcone)、木犀草素(C₂₁,luteolin)、苯乙基肉桂酰胺(C₂₂,phenethylcinnamide)、3’,7-二羥基-2’,4’-二甲氧基異黃烷(C₂₃,3’,7-dihydroxy-2’,4’-dimethoxyisoflavane)、7-羥基黃酮(C₂₄,7-hydroxyflavone)、2’-羥基苯乙基肉桂酰胺(C₂₆,2’-hydroxyphenethylcinnamide)、異甘草素(C₂₈,isoliquiritigenin)、異鼠李素(C₂₉,isorhamnetin)、槲皮素(C₃₀,quercetin)、楊梅素(C₃₁,myricetin)、山奈酚(C₃₂,kaempferol)、鄰苯二甲酸二異丁酯(C₃₃,diisobutylphthalate)和β-胡蘿卜苷(C₃₄,β-daucosterol)。其中,A₁、A₂、B₄、B₇、B₈、B₁₀/C₁₉、B₁₂、B₁₃、B₁₄、C₁₆、C₁₈、C₂₀、C₂₁、C₂₂、C₂₄、C₂₆、C₃₀、C₃₁和C₃₃等19個(gè)化合物為首次從鐮形棘豆中分離得到;A₂、B₄、B₇、B₁₀/C₁₉、B₁₂、B₁₃、B₁₄、C₂₀、C₂₄和C₃₃等10個(gè)化合物為首次從棘豆屬植物中分離得到。此外,還有1個(gè)生物堿類化合物和2個(gè)黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)尚未確定。4.鐮形棘豆中黃酮苷元類化合物的含量測定選擇了藏藥鐮形棘豆中5種含量較高的黃酮苷元（5-羥基-7-甲氧基二氫黃酮、2’,4’-二羥基二氫查兒酮、2’,4’-二羥基查兒酮、5,7-二羥基二氫黃酮和7-羥基二氫黃酮）,通過對(duì)檢測波長、流動(dòng)相組成、色譜柱等影響因素的優(yōu)選,建立了一套簡便易行、穩(wěn)定準(zhǔn)確、分離效果好的分析方法。即:色譜柱為AgilentZorbaxEclipseXDB-C₈（5μm,4.6mm×150mm）;流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）;梯度洗脫程序?yàn)?～50min,A由75%降至50%,50～60min,A由50%降至40%,60～65min,A由40%升至75%,65～70min,A保持75%;流速為1.0mL/min;檢測波長為280nm(B₄、B₅、B₇、B₁₀)和365nm（B₆）;柱溫為20℃;進(jìn)樣量為5μL。在該條件下,B₄、B₅、B₆、B₇、B₁₀分別在0.101～0.707μg、0.029～0.203μg、0.332～2.324μg、0.134～0.938μg和0.122～0.854μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r分別為0.9996、0.9998、0.9998、0.9996和0.9998,其精密度（n=6）處于0.61%～1.64%之間;該方法的重復(fù)性良好（n=5,RSD＜2%）,且樣品溶液在48h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定;該方法的平均回收率在96.9%～101.2%之間,RSD均小于2%;測定了三個(gè)產(chǎn)地（青海共和縣、西藏班戈縣、甘肅酒泉縣）的鐮形棘豆樣品中各黃酮苷元的含量,其中B₄的含量分別為0.16%、0.17%和0.09%;B₅的含量分別