大黃、關(guān)黃柏、澤蘭、側(cè)柏葉及雙柏噴膜劑經(jīng)皮滲透特征圖譜特性研究

大黃、關(guān)黃柏、澤蘭、側(cè)柏葉及雙柏噴膜劑經(jīng)皮滲透特征圖譜特性研究雙柏散是廣州中醫(yī)藥大學(xué)的經(jīng)驗(yàn)方,該方由大黃、側(cè)柏葉、關(guān)黃柏、澤蘭、薄荷等五味藥組成,具有活血化瘀、清熱解毒、消腫止痛之功效,在臨床上被廣泛應(yīng)用于急性軟組織損傷、瘡瘍、褥瘡、骨折、靜脈炎等疾病的治療。課題組針對(duì)雙柏散傳統(tǒng)劑型的不足,研制出雙柏噴膜劑,該劑型兼顧了噴霧劑和膜劑的雙重優(yōu)點(diǎn)。本研究在課題組前期對(duì)雙柏散及組方藥味進(jìn)行了經(jīng)皮滲透初步研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化特征圖譜分析方法及經(jīng)皮滲透參數(shù),研究大黃、關(guān)黃柏、澤蘭、側(cè)柏葉及雙柏噴膜劑經(jīng)皮滲透特征圖譜,探討中藥不同類型成分群經(jīng)皮滲透的特性。目的：1、建立大黃、關(guān)黃柏、澤蘭及側(cè)柏葉的HPLC特征圖譜分析方法,為質(zhì)量控制及經(jīng)皮滲透試驗(yàn)提供分析手段；分析該四味中藥及其提取物HPLC特征圖譜的相關(guān)性。2、建立雙柏噴膜劑HPLC特征圖譜分析方法,擬定不同類成分群的特征圖譜,為質(zhì)量控制及經(jīng)皮滲透試驗(yàn)提供分析手段。3、采用中藥特征圖譜技術(shù)與經(jīng)皮滲透試驗(yàn)相結(jié)合的方法,分別建立大黃、關(guān)黃柏、澤蘭及側(cè)柏葉醇提物及水煎液的經(jīng)皮滲透特征圖譜,探討中藥不同類成分群的經(jīng)皮滲透特性,比較薄荷腦對(duì)不同類成分群的促透影響。4、建立雙柏噴膜劑不同類成分群的經(jīng)皮滲透特征圖譜,探討雙柏噴膜劑中不同類成分群的經(jīng)皮滲透特性；通過(guò)雙柏噴膜劑與單味藥透過(guò)率常數(shù)的比較,闡明雙柏噴膜劑經(jīng)皮滲透優(yōu)勢(shì)及工藝合理性。方法：1、采用中藥HPLC特征圖譜技術(shù),建立大黃、關(guān)黃柏、澤蘭及側(cè)柏葉HPLC特征圖譜分析方法；采用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版),分析該四味中藥與其提取物特征圖譜的相關(guān)性。2、采用兩種檢測(cè)波長(zhǎng)建立雙柏噴膜劑的HPLC特征圖譜,430nm波長(zhǎng)分析蒽醌類成分,280nnm波長(zhǎng)分析酚酸類、生物堿類、黃酮類及其他類成分群。3、應(yīng)用體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)方法,研究大黃、關(guān)黃柏、澤蘭、側(cè)柏葉的醇提物與其水煎液及雙柏噴膜劑的經(jīng)皮滲透特性。采用Franze擴(kuò)散池法,以離體裸鼠腹皮為透皮屏障,生理鹽水為接收液,接收液收集時(shí)間段為2、4、6、8、10、12h；根據(jù)臨床使用習(xí)慣,調(diào)整醇溶液、水煎液的試驗(yàn)溫度分別為(32±0.5)℃、(37±0.5)℃。采用建立的HPLC特征圖譜分析方法,分析各樣品經(jīng)皮滲透前后的特征圖譜；采用SPSS軟件的相關(guān)系數(shù)法分析樣品經(jīng)皮滲透前后特征圖譜的相似度。4、結(jié)合中藥特征圖譜技術(shù)與經(jīng)皮滲透試驗(yàn)方法,參考主成分經(jīng)皮滲透參數(shù)的計(jì)算方法,根據(jù)各樣品經(jīng)皮滲透前后供試品溶液的特征峰面積,擬定經(jīng)皮滲透特征圖譜的參數(shù)：(1)特征峰累積透過(guò)折算峰面積(QA)；(2)特征峰面積累積透過(guò)率(QA%)；(3)特征峰累積透過(guò)率-時(shí)間零級(jí)方程(QA%-JA*t+B)、特征峰透過(guò)率常數(shù)(JA,h-1)及零級(jí)方程相關(guān)系數(shù)r,；(4)特征峰累積透過(guò)率-時(shí)間一級(jí)方程(OA%=JB*t1/2+C)及一級(jí)方程相關(guān)系數(shù)r2。成果：1、優(yōu)化了大黃、關(guān)黃柏、澤蘭及側(cè)柏葉的HPLC特征圖譜分析方法,分析了該四味中藥及其提取物特征圖譜的相關(guān)性。(1)優(yōu)選430nm.280nm兩種檢測(cè)波長(zhǎng),分別對(duì)大黃蒽醌類及其他類成分進(jìn)行了HPLC特征圖譜的分析研究。在430nm波長(zhǎng)下,標(biāo)示出14個(gè)蒽醌類共有峰,鑒別了5個(gè)游離蒽醌類成分(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)；在280nm波長(zhǎng)下,標(biāo)示出10個(gè)共有峰,鑒別了2個(gè)特征成分(沒食子酸、兒茶素)；同批次大黃及醇提液在430nm.280nm波長(zhǎng)下的相似度分別為0.992-0.999、0.987～0.999,提示常規(guī)醇提工藝能保留大黃的主要特征成分。(2)關(guān)黃柏標(biāo)示出18個(gè)共有峰,關(guān)黃柏精制提取物能檢出關(guān)黃柏中的15～17個(gè)共有峰,鑒別了4個(gè)特征峰(木蘭堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿)；同批次關(guān)黃柏及其精制提取物之間的相似度為0.926～0.999,提示醇提大孔樹脂精制工藝能保留關(guān)黃柏的主要特征成分。(3)澤蘭及其精制提取物均標(biāo)示出20個(gè)共有峰,鑒別了1個(gè)特征峰(咖啡酸)；同批次澤蘭及其精制提取物之間的相似度為0.988～0.998,提示醇提大孔樹脂精制工藝基本能保留澤蘭的主要特征成分。(4)側(cè)柏葉及其提取物均標(biāo)示出18個(gè)共有峰,鑒別了2個(gè)特征峰(槲皮苷、槲皮素)；同批次側(cè)柏葉及其水煎液之間的相似度為0.779～0.985,提示水煎煮基本能保留側(cè)柏葉的主要特征成分,但特征峰相對(duì)比值變化較大。2、建立了大黃、關(guān)黃柏、澤蘭、側(cè)柏葉等醇溶液、含0.1%薄荷腦醇溶液及水煎液的經(jīng)皮滲透特征圖譜,獲得了四味中藥主要成分群的經(jīng)皮滲透特性。(1)430nm波長(zhǎng)下,大黃醇溶液及水煎液的蒽醌類成分群基本能經(jīng)皮滲透,但經(jīng)皮滲透前后特征圖譜的特征峰相對(duì)比值差異均很大,相似度僅為0.394～0.568,而不同時(shí)間段接收液之間的相似度則大于0.84。大黃低、中、高三種濃度醇溶液的10個(gè)蒽醌類特征峰的透過(guò)率常數(shù)JA為0.003～0.183,相差約61倍；其中峰5、峰7(大黃酸)、峰6(蘆薈大黃素)的JA較大,分別為0.069～0.183、0.036～0.118、0.021-0.034,其他峰的JA小于0.029；峰8(大黃素)、峰9(大黃酚)及峰10(大黃素甲醚)的JA僅為0.003～0.012,基本小于其他蒽醌類特征峰。加0.1%薄荷腦后,大黃醇溶液蒽醌類特征峰的JA增加0.02～0.90倍；大黃水煎液蒽醌類成分的經(jīng)皮滲透性能明顯優(yōu)于醇溶液。280nm波長(zhǎng)下,大黃醇溶液及水煎液的酚酸類及其他成分群基本能經(jīng)皮滲透,但經(jīng)皮滲透前后特征圖譜的特征峰相對(duì)比值差異均很大,相似度小于0.766,而不同時(shí)間段接收液之間的相似度則大于0.49。大黃低、中、高三種濃度醇溶液的10個(gè)酚酸類及其他類成分特征峰的透過(guò)率常數(shù)JA為0.023～1.199,相差約52倍；其中峰1～峰2的JA為0.036～0.238,峰9的JA較大,均大于0.36,明顯大于其他9個(gè)特征峰；加0.1%薄荷腦后,大黃醇溶液酚酸及其他類成分特征峰的JA基本增加0.02～0.37倍；大黃水煎液中的經(jīng)皮滲透性能類似醇溶液。(2)關(guān)黃柏醇溶液及水煎液的生物堿類及其他類成分群基本能經(jīng)皮滲透,經(jīng)皮滲透前后特征圖譜的特征峰相對(duì)比值差異均較小,相似度為0.881～0.969,而不同時(shí)間段接收液之間的相似度則為0.841-0.999,相似度較高。關(guān)黃柏低、中、高三種濃度醇溶液的13個(gè)生物堿類特征峰的透過(guò)率常數(shù)JA為0.041～1.651,其中峰4(木蘭堿)、峰10(藥根堿)和峰11(巴馬汀)及峰12(小檗堿)的JA分別大于0.06、0.05、0.06、0.07,而峰13的JA較大,均大于0.94；加0.1%薄荷腦后,關(guān)黃柏醇溶液生物堿類特征峰的JA增加0,01～1.08倍；關(guān)黃柏水煎液生物堿類成分的經(jīng)皮滲透性能類似醇溶液,但與醇提液相比,其JA相對(duì)較小,經(jīng)皮滲透性能相對(duì)較差。(3)澤蘭醇溶液及水煎液的酚酸類及其他類成分群基本能經(jīng)皮滲透,醇溶液經(jīng)皮滲透前后特征圖譜的特征峰相對(duì)比值差異均很大,相似度為0.465～0.915,而不同時(shí)間段接收液之間的相似度則為0.564-0.999。澤蘭醇溶液、含0.1%薄荷腦醇溶液及水煎液的12個(gè)酚酸類及其他類成分特征峰的透過(guò)率常數(shù)JA為0.006～0.329,其中峰2(咖啡酸)的JA較大,為0.097～0.235；加0.1%薄荷腦后,除了峰1的JA促透倍數(shù)增加很大外,澤蘭醇溶液酚酸類及其他類成分特征峰的JA增加0.07～1.82倍；澤蘭水煎液酚酸類及其他類成分的經(jīng)皮滲透性能類似醇溶液,但與醇提液相比,JA相對(duì)較大,其經(jīng)皮滲透性能相對(duì)較好。(4)側(cè)柏葉醇溶液及水煎液的黃酮類及其他類成分群基本能經(jīng)皮滲透,經(jīng)皮滲透前后特征圖譜的特征峰相對(duì)比值差異均很大,相似度為0.158～0.918,而不同時(shí)間段接收液之間的相似度則為0.634～0.992。側(cè)柏葉醇溶液、含0.1%薄荷腦醇溶液及水煎液的12個(gè)黃酮類及其他類成分特征峰的透過(guò)率常數(shù)JA為0.006～0.346,其中峰11(槲皮苷)的JA為0.006～0.053；加0.1%薄荷腦后,側(cè)柏葉醇溶液黃酮類及其他類成分特征峰的JA增加0.26～6.06倍,其中,峰11(槲皮苷)、峰13(槲皮素)的JA分別增加3.55、2.37倍；側(cè)柏葉水煎液黃酮類及其他類成分的經(jīng)皮滲透性能類似醇溶液,但與醇提液相比,JA相對(duì)較大,其經(jīng)皮滲透性能較好。3、建立了雙柏噴膜劑的經(jīng)皮滲透特征圖譜,獲得了雙柏噴膜劑主要成分群的經(jīng)皮滲透特性。(1)430nm波長(zhǎng)下,雙柏噴膜劑蒽醌類成分群基本能經(jīng)皮滲透,但經(jīng)皮滲透前后特征圖譜的特征峰相對(duì)比值差異較大,相似度為0.793,而不同時(shí)間段接收液之間的相似度則為0.988～0.998。雙柏噴膜劑10個(gè)蒽醌類特征峰的透過(guò)率常數(shù)JA為0.012～0.696,峰1～峰7的JA為0.130-0.696,其中峰5、峰6(蘆薈大黃素)和峰7(大黃酸)的JA較大,分別為0.366、0.391、0.696,明顯大于其他蒽醌類特征峰；而峰8(大黃素)、峰9(大黃酚)及峰10(大黃素甲醚)的JA分別為0.028、0.048、0.012,明顯小于其他蒽醌類特征峰。(2)280nm波長(zhǎng)下,雙柏噴膜劑酚酸類、生物堿類、黃酮類及其他類成分群基本能經(jīng)皮滲透,但經(jīng)皮滲透前后特征圖譜的特征峰相對(duì)比值差異很大,相似度僅為0.409,而不同時(shí)間段接收液之間的相似度則為0.986～0.999,雙柏噴膜劑18個(gè)酚酸類、生物堿類、黃酮類及其他類成分特征峰的透過(guò)率常數(shù)JA為0.050-1.939,其中峰1(沒食子酸)、峰4(咖啡酸)、峰7(木蘭堿)、峰17(小檗堿)和峰18(巴馬汀)的JA較大,分別為0.212、0.354、0.163、0.184、0.157。4、開展了雙柏噴膜劑與四味中藥的經(jīng)皮滲透特性分析,初步獲得中藥不同類成分群的經(jīng)皮滲透特性。(1)不同樣品特征峰累積透過(guò)率-時(shí)間零級(jí)方程的相關(guān)系數(shù)r1基本大于特征峰累積透過(guò)率-時(shí)間一級(jí)方程的相關(guān)系數(shù)r2,提示在試驗(yàn)皮膚活性較佳的情況下,中藥經(jīng)皮滲透呈現(xiàn)較勻速的狀態(tài)。(2)雙柏噴膜劑蒽醌類成分經(jīng)皮滲透性能優(yōu)于大黃醇溶液及含0.1%薄荷腦的大黃醇溶液,表明雙柏噴膜劑含有的促透劑對(duì)其蒽醌類成分具有優(yōu)異的促透作用；雙柏噴膜劑酚酸類、生物堿類、黃酮類及其他類成分特征峰中,峰1(沒食子酸)、峰4(咖啡酸)、峰7(木蘭堿)、峰14(槲皮苷)、峰17(小檗堿)和峰18(巴馬汀)的經(jīng)皮滲透性能優(yōu)于關(guān)黃柏、澤蘭、側(cè)柏葉醇溶液及含0.1%薄荷腦的相應(yīng)醇溶液,表明雙柏噴膜劑含有的促透劑對(duì)蒽醌類、酚酸類、生物堿類、黃酮類及其他類成分具有優(yōu)異的促透作用,進(jìn)一步闡明了雙柏噴膜劑工藝合理,符合外用藥的經(jīng)皮滲透需要。(3)四味中藥的醇溶液中,大黃酚酸類及其他類成分的JA為0.057～0.304,其中峰1(沒食子酸)的為0.238,其經(jīng)皮滲透性能基本優(yōu)于大黃蒽醌類成分(JA為0.014～0.174)和其他三味中藥；關(guān)黃柏生物堿類及其他類成分特征峰的JA為0.080～0.176,其中峰4(木蘭堿)、峰11(巴馬汀)及峰12(小檗堿)的JA分別為0.139、0.147、0.176,其經(jīng)皮滲透性能優(yōu)于側(cè)柏葉和澤蘭；側(cè)柏葉峰1-7的JA為0.015～0.086,其經(jīng)皮滲透性能稍優(yōu)于澤蘭,但澤蘭的峰2(咖啡酸)的JA為0.137,經(jīng)皮滲透性能與關(guān)黃柏相當(dāng)。(4)四味中藥的水煎液中,大黃酚酸類及其他類成分的經(jīng)皮滲透性能基本優(yōu)于蒽醌類成分；在側(cè)柏葉水煎液中,黃酮類及其他類成分的經(jīng)皮滲透性能與大黃酚酸類及其它類成分相當(dāng),其中峰1的JA為0.545,明顯要大于其它類成分群的峰；澤蘭水煎液的經(jīng)皮滲透性能稍弱于于側(cè)柏葉水煎液；在關(guān)黃柏水煎液中,主要特征峰的JA均JA小于0.080,經(jīng)皮滲透性能基本弱于其它三味中藥。結(jié)論：1、優(yōu)化的大黃、關(guān)黃柏、澤蘭、側(cè)柏葉HPLC特征圖譜分析方法可行,可用于藥材質(zhì)量控制及作為工藝研究的參考；建立的雙柏噴膜劑HPLC特征圖譜分析方法可行,可兼顧分析不同類型成分群,為制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供了方法依據(jù)；雙柏噴膜劑中不同類成分群的經(jīng)皮滲透性能均優(yōu)于單味藥的經(jīng)皮滲透性能,提示雙柏噴膜劑工藝合理。2、中藥不同類成分基本能經(jīng)皮滲透,但經(jīng)皮滲透性能差異很大