發(fā)酵工程第10講

第十二章發(fā)酵工程下游加工技術(shù)

上游

原料

原料處理培養(yǎng)基的配制、設(shè)計與滅菌菌種的選育保藏菌種種子制備發(fā)酵培養(yǎng)

空氣空氣除菌無菌空氣

下游發(fā)酵液預(yù)處理初步純化精制加工成品

工藝、設(shè)備、傳統(tǒng)、現(xiàn)代

第十二章下游加工工程

一、下游加工工程概論二、發(fā)酵液的預(yù)處理三、發(fā)酵液的固液分離四、細(xì)胞的破碎五、發(fā)酵產(chǎn)品的提取六、發(fā)酵產(chǎn)物的精制

七、成品的加工

一、微生物下游加工工程概論1、下游加工過程在發(fā)酵生產(chǎn)中的地位

從微生物發(fā)酵液中分離、精制發(fā)酵產(chǎn)品的過程稱為下游加工過程（downstreamprocess)。

下游加工的目標(biāo)：高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、低耗按下游加工過程的難易程度，微生物的發(fā)酵產(chǎn)品可分為三類：

a.如啤酒、葡萄酒、各種發(fā)酵飲料等。下游成本占生產(chǎn)成本的10%左右。

b.如乙醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、維生素等。下游成本占生產(chǎn)成本的30%左右，能耗占60%以上，下游投資占整個工廠投資的60%左右。

c.重組DNA產(chǎn)品、精制蛋白質(zhì)產(chǎn)品。下游成本占生產(chǎn)成本的80%~90%，而且這種偏向還有繼續(xù)加劇的趨勢。2、下游加工過程的特點：微生物發(fā)酵產(chǎn)品的品種很多，其下游加工過程一般有以下特點：a.成分復(fù)雜：發(fā)酵液是復(fù)雜的多相系統(tǒng)。含有細(xì)胞、代謝產(chǎn)物和殘留的培養(yǎng)基等。b.產(chǎn)品濃度低：傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)物濃度僅酒精、檸檬酸、葡萄糖酸在10%以上，一般在1%~10%，活性物質(zhì)產(chǎn)品為0.01%~1%。

c.收率較低：由于雜質(zhì)多，產(chǎn)品質(zhì)量要求高，多步操作。d.失活問題：生物活性物質(zhì)通常很不穩(wěn)定。遇熱、有機(jī)溶劑、某些金屬離子等引起失活或分解。e.生物安全問題：對于某些基因工程產(chǎn)品，應(yīng)注意生物安全問題，防止菌體的擴(kuò)散。

3、下游加工過程的一般操作流程

胞外產(chǎn)物

發(fā)酵液→預(yù)處理→細(xì)胞分離→細(xì)胞破碎→細(xì)胞碎片分離→提取

加熱過濾勻漿過濾（初步純化）調(diào)pH離心研磨

離心吸附絮凝溶胞萃取超聲波沉淀蒸餾

→精制→成品加工

（高度純化）層析濃縮離子交換干燥

電泳無菌過濾結(jié)晶包裝二、發(fā)酵液的預(yù)處理1、過濾特性的改變1.1降低液體黏度

1.1.1加水稀釋法：可降低液體黏度，降低產(chǎn)物濃度，增加后續(xù)的處理量，應(yīng)注意適量加水。

1.1.2加熱升溫法：降低液體黏度，提高過濾效率，注意對目的產(chǎn)物的影響。

1.1.3降解法：發(fā)酵液中如含有多糖物質(zhì)，最好用酶將其轉(zhuǎn)化成單糖，以提高過濾的效率。如萬古霉素發(fā)酵液過濾前加入0.025%的淀粉酶。

1.2凝聚與絮凝

1.2.1凝聚：加入某種電解質(zhì)，在電解質(zhì)異電離子的作用下，膠粒的雙電層電位降低，產(chǎn)生凝聚現(xiàn)象。凝聚能力Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+

1.2.2絮凝：絮凝是指在某些高分子絮凝劑的作用下，基于橋架作用，使膠粒形成較大的絮凝團(tuán)的過程。發(fā)酵工業(yè)常用的是：聚丙烯酰胺類衍生物（用量70mg/L)、天然有機(jī)高分子聚合物（明膠、海藻酸鹽等）、無機(jī)高分子聚合物（聚合鋁鹽、聚合鐵鹽）。

1.2.3混凝：包括凝聚、絮凝的雙重作用。1.3調(diào)整pH

調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH使之達(dá)到其等電點，可去除蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)。1.4加入助濾劑在含有大量細(xì)小膠體粒子的發(fā)酵液中加入固體助濾劑，助濾劑可作為細(xì)小膠體粒子的載體，均勻地分布于濾餅層中，減小過濾的阻力。目前工業(yè)生產(chǎn)常用的助濾劑：硅藻土、珍珠巖粉、石英沙等。2去除高價無機(jī)離子Ca2+、Mg2+、Fe2+等影響樹脂的交換容量2.1用草酸去除鈣離子，草酸鈣還能促進(jìn)蛋白質(zhì)凝固2.2三聚磷酸鈉與鎂形成可溶性絡(luò)合物

Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+2.3黃血鹽與鐵離子形成普魯土鹽沉淀

3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3

+12K+

3去除色素及其它物質(zhì)3.1色素產(chǎn)生微生物生長代謝產(chǎn)生，培養(yǎng)基帶來3.2去除方法離子交換劑、離子交換纖維、活性炭（青霉素提取）等吸附如DEAE-纖維素從含酶溶劑中吸附色素物質(zhì)時，可同時去除非活性蛋白質(zhì)三發(fā)酵液的固液分離1板框壓濾機(jī)比較適合固形物含量：1%~10%的懸浮液的分離。優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單、過濾面積大、形成的固形物水份低。缺點：設(shè)備笨重、非生產(chǎn)的輔助時間長，衛(wèi)生條件較差?？蛇^濾體積：V=n×a×b×cn為框數(shù)，a、b、c為框內(nèi)的長、寬、厚度。

V臺=K×VK為每臺板框的壓填系數(shù)（抗生素一般為：0.5~0.8）。過濾后注意頂水!

傳統(tǒng)板框壓濾機(jī)

1-尾板；2—濾框；3—濾板；4—主梁；5—頭板；6—壓緊裝置全自動板框壓濾機(jī)油壓機(jī)拉開板框，使板框到既定的距離，用濾框升降架帶著全部濾框下降到圖位置，再啟動濾餅推動板，將濾框內(nèi)的濾餅沿水平方向推出落下。在拉開板框后，即可啟動驅(qū)動裝置牽引濾布循環(huán)行進(jìn)，在這過程中，有防止濾布歪斜裝置自動調(diào)整，同時刷洗濾布。

2真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)

外濾面轉(zhuǎn)鼓真空過濾機(jī)

1—轉(zhuǎn)鼓2—過濾室3—分配頭4—物料槽

5—攪拌器6—噴嘴10—刮刀

適合固形物含量較大（>10%）的懸浮液的分離。工業(yè)生產(chǎn)上適合霉菌發(fā)酵液的過濾分離。由于其推動力為（真空度）的限制，其固相的干度不如壓濾。3疊片式離心機(jī)

屬于沉降式的離心機(jī)，是工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的離心機(jī)。一般用于大規(guī)模的分離過程。四細(xì)胞的破碎細(xì)胞的破碎分為：機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法1機(jī)械破碎法1.1珠磨法：微生物細(xì)胞懸浮液與很細(xì)的研磨劑在攪拌槳作用下快速攪拌或研磨，珠子之間以及珠子和細(xì)胞之間互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放內(nèi)含物。在珠液分離器的作用下進(jìn)行分離。

1.2高壓均質(zhì)(勻漿）法：從高壓室（幾百個大氣壓）壓出的細(xì)胞懸浮液在高壓下從閥室與閥桿之間的環(huán)隙高速(450m/s)噴出，由于突然減壓和高速沖擊(撞擊到碰撞環(huán))作用使細(xì)胞破碎。對于難以破碎、濃度高的細(xì)胞懸浮液可采用多次循環(huán)操作。影響細(xì)胞破碎的主要因素是壓力、溫度和循環(huán)次數(shù)。

ln1/(1–R)=KNPα

R—破碎率，K—與溫度有關(guān)的速度常數(shù)，N—操作壓力，α—與微生物種類有關(guān)的常數(shù)，P—循環(huán)次數(shù)1.3超聲波法：是一種實驗室內(nèi)常用的細(xì)胞破碎方法，由極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力引起細(xì)胞破碎，超聲波震蕩容易引起溫度的劇烈上升，注意降溫。超聲波法處理各種微生物的效果不同，一般桿菌好于球菌，G–好于G+

酵母的破碎效果較差。

2非機(jī)械破碎法

2.1酶溶法：利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵，從而達(dá)到細(xì)胞破碎的目的。此法要注意選擇適宜的酶及酶系統(tǒng)，還要注意和其他方法復(fù)合應(yīng)用。2.2化學(xué)滲透法：某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬鰲合劑等可以改變細(xì)胞壁、膜的通透性。

3細(xì)胞破碎率的測定：

直接測定法，測定蛋白質(zhì)質(zhì)量或酶活力，以及測定導(dǎo)電率等。

五發(fā)酵產(chǎn)品的提取1沉淀法沉淀法是分離和純化生物物質(zhì)和發(fā)酵產(chǎn)品過程最常用、最簡單的方法之一。是目前工業(yè)生產(chǎn)上廣泛采用的方法。1.1鹽析法：1.1.1鹽析法原理：鹽析又稱中性鹽沉淀法，在發(fā)酵液中加入中性鹽破壞蛋白質(zhì)或酶的膠體性質(zhì)，消除微粒上的電荷，促進(jìn)蛋白質(zhì)或酶沉淀。

1.1.2影響鹽析的主要因素：

a.蛋白質(zhì)濃度：一般來說，高濃度的蛋白質(zhì)溶液可以減少鹽的用量，低濃度的蛋白質(zhì)溶液需要較多的鹽，常采用25%~30%的蛋白質(zhì)濃度。

b.鹽析劑的種類：鹽析效果好且常用的鹽析劑有

(NH4)2SO4，Na2SO4，NaH2PO3等。

c.鹽析劑的用量：鹽析劑的用量與所沉淀的酶的種類和酶液中的雜質(zhì)的性質(zhì)、數(shù)量有關(guān)，應(yīng)以收率最高的用量為標(biāo)準(zhǔn)。具體用量需通過對比試驗和生產(chǎn)實踐摸索才能得到。如：目前生產(chǎn)淀粉酶（BF7658），(NH4)2SO4用量為40%，生產(chǎn)葡萄糖氧化酶，(NH4)2SO4用量為70%。

d.鹽析的溫度：鹽析的溫度選擇以不降低酶的活力為原則，可供選擇的范圍較大，一般是在常溫下進(jìn)行鹽析。

e.鹽析的pH：鹽析的pH選擇以不降低酶的活力為原則，可選擇等電點的pH作為鹽析的pH，一般要通過試驗選擇產(chǎn)物穩(wěn)定的pH范圍進(jìn)行鹽析。

1.2等電點法：等電點法主要用于一些兩性電解質(zhì)的產(chǎn)物中，如抗生素、氨基酸以及水化程度不大或憎水性的蛋白質(zhì)如酪蛋白等，其優(yōu)點是無需后續(xù)的脫鹽操作。

1.3有機(jī)溶劑沉淀：向蛋白質(zhì)溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性的有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑分子能與大量的水分子結(jié)合，當(dāng)其達(dá)到一定濃度時，蛋白質(zhì)分子表面的水化層被破壞，溶液的介電常數(shù)下降，蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增大，從而凝聚和沉淀。一般來說，蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量越大，沉淀越易，所需加入的有機(jī)溶劑量也越少。

2萃取法：萃取指任意兩相之間的傳質(zhì)過程。2.1溶媒萃取法：溶媒萃取法比化學(xué)沉淀法分離程度高。廣泛用于抗生素、有機(jī)酸、維生素、激素等發(fā)酵產(chǎn)物的提取。2.1.1單級萃?。褐挥靡粋€混合器和一個分離器的萃取稱為單級萃取。2.1.2多級錯流萃?。河蓭讉€萃取器串聯(lián)而成。2.1.3多級逆流萃?。毫弦号c萃取劑分別兩端加入。2.2雙水相萃取法：溶媒萃取法難以用在蛋白質(zhì)的分離上，一方面許多的蛋白質(zhì)都有極強(qiáng)的親水性，不溶于有機(jī)溶劑，另一方面蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑相中易變性失活。

雙水相萃取法是近年出現(xiàn)的很有價值的新型分離技術(shù)。目前，已有數(shù)十種酶可用此法提取，此外，雙水相萃取法還可以分離核酸、生長素、病毒、干擾素、細(xì)胞組織等。雙水相形成：絕大多數(shù)天然或合成的親水性的聚合物（如：聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯醇等）水溶液，在與第二種親水性聚合物或無機(jī)鹽（K3PO4，MgSO4

（

NH4)2SO4混合，并達(dá)到一定的濃度時，就會產(chǎn)生兩相。如：PEG40006.6%/磷酸鹽14%體系，提取人生長激素，hGH分配在上相，細(xì)胞碎片等在下相，經(jīng)過三級錯流萃取，總收率達(dá)到81%。

2.3反（逆）膠束（團(tuán)）萃取法：當(dāng)表面活性劑溶于水中，并使其濃度超過臨界膠團(tuán)濃度CMC（CriticalMicelleConcentration)時，表面活性劑就會在水溶液中形成集聚體，稱為正常膠束（normalmicelle)。

反膠束(reversedmicelle)是表面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中自發(fā)形成的納米尺度的聚集體，具有熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)。反膠束中有一個極性核心，被稱之為“水池”。當(dāng)含有此種反膠束的有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)的水溶液接觸后，蛋白質(zhì)及其他親水物質(zhì)能夠通過螯合作用進(jìn)入“水池”，由于周圍水層和極性基團(tuán)的保護(hù)，保持了蛋白質(zhì)的天然構(gòu)型，因而不會造成失活。

反膠束常用的表面活性劑有：AOT琥珀酸二酯磺酸鈉，CTAB溴代十六烷基三甲銨，TOMAC氯化三辛基甲銨。非極性的有機(jī)溶劑有環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷。

3離子交換：離子交換樹脂是一種不溶于酸、堿和有機(jī)溶劑的固態(tài)高分子材料，能與發(fā)酵液中帶電荷的物質(zhì)進(jìn)行陰、陽離子交換。發(fā)酵生產(chǎn)上廣泛用于抗生素、氨基酸、有機(jī)酸等的提取與精制以及水處理和蛋白質(zhì)制備過程中。

3.1離子交換樹脂的原理：離子交換樹脂可以分成兩部分：一部分是不能移動的高分子基團(tuán)構(gòu)成的三維空間網(wǎng)狀骨架，使樹脂具有化學(xué)穩(wěn)定的性質(zhì)；另一部分是可移動的離子，稱為活性離子，它在樹脂的骨架中進(jìn)出，就發(fā)生了離子的交換。

3.2離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)與分類：根據(jù)活性離子進(jìn)行分類，如果活性離子是陽離子，即這種樹脂能與陽離子發(fā)生交換。就稱為陽離子交換樹脂。離子電離程度決定樹脂的酸性或堿性的強(qiáng)弱。陽離子交換樹脂是一類骨架上結(jié)合有磺酸（—SO3H）或羧酸（—COOH），陰離子交換樹脂骨架上結(jié)合有伯胺基、仲胺基、叔胺基、季胺基的聚合物。

3.2.1強(qiáng)酸性陽離子樹脂：

R·SO3HR·SO3–+H+3.2.2弱酸性陽離子樹脂：

R·COOHR·COO–+H+

3.2.3強(qiáng)堿性陽離子樹脂：(含季胺基）

R·NR3OHR·NR3++OH–

3.2.4弱堿性陽離子樹脂:R·NH2

+H2OR·NH3++OH–離子交換樹脂在使用一段時間后，需進(jìn)行再生處理，使樹脂恢復(fù)原來的狀態(tài)。酸型樹脂用酸再生，堿型樹用堿再生3.3其他類型的樹脂：3.3.1兩性離子交換樹脂：將兩種性質(zhì)相反的陰、陽離子交換官能團(tuán)連接在同一樹脂骨架上，就構(gòu)成兩性樹脂。3.3.2選擇性離子交換樹脂：又叫鰲合性離子交換樹脂，它對某些金屬離子有特殊選擇性的樹脂，其選擇性高于一般的強(qiáng)酸性和弱酸性樹脂。3.3.3吸附樹脂：吸附樹脂具有多孔性、表面積大、吸附能力強(qiáng)、交換能力很小甚至不交換等特點，一般用于脫色和吸附大分子產(chǎn)物等。3.3.4氧化還原樹脂：這類樹脂不是進(jìn)行離子交換而是電子轉(zhuǎn)移，能起氧化還原作用，又叫電子交換樹脂。4蒸餾：

蒸餾是將液-固、液-液混合物分離成較純或近于純態(tài)組分的單元操作，它利用液體混合物中各組分揮發(fā)性不同，達(dá)到分離各組分的目的。目前，全世界的發(fā)酵酒精工業(yè)中，都利用這一方法從成熟發(fā)酵醪中回收酒精。此外，白酒、丙酮、丁純等發(fā)酵產(chǎn)品以及某些萃取過程中的溶劑回收常采用蒸餾方法提取和精制。

蒸餾工藝流程：酒精蒸餾的流程系根據(jù)產(chǎn)品質(zhì)量的要求與發(fā)酵成熟醪的組成確定，常見的流程有單塔式、雙塔式、三塔式和多塔式及差壓蒸餾技術(shù)等。

雙塔式酒精連續(xù)精餾流程圖

1—粗餾塔（醪塔，塔板21~24快）2—精餾塔（塔板56~70快）

3—預(yù)熱器4—分凝器5—冷凝冷卻器6—冷卻器7—排醛器

4.1成熟醪預(yù)熱

用2號塔排出的蒸汽對成熟醪進(jìn)行預(yù)熱，使成熟醪達(dá)40℃雙塔式酒精連續(xù)精餾流程圖

1—粗餾塔（醪塔，塔板21~24快）2—精餾塔（塔板56~70快）

3—預(yù)熱器4—分凝器5—冷凝冷卻器6—冷卻器7—排醛器雙塔式酒精連續(xù)精餾流程圖

1—粗餾塔（醪塔，塔板21~24快）2—精餾塔（塔板56~70快）

3—預(yù)熱器4—分凝器5—冷凝冷卻器6—冷卻器7—排醛器4.2粗餾：粗餾塔有21—24塊塔板，塔頂溫度92—95℃，塔底溫度105—108℃。粗餾是將揮發(fā)性成分與不揮發(fā)的雜質(zhì)分開，揮發(fā)性成分包括：醇、醛、酸、酯（統(tǒng)稱粗酒精），不揮發(fā)性雜質(zhì)包括：甘油、乳酸、無機(jī)鹽、酵母等。雙塔式酒精連續(xù)精餾流程圖

1—粗餾塔（醪塔，塔板21~24快）2—精餾塔（塔板56~70快）

3—預(yù)熱器4—分凝器5—冷凝冷卻器6—冷卻器7—排醛器4.3精餾：精餾塔有56—70塊塔板，塔頂溫度78℃，塔底溫度105—108℃，塔中溫度92℃。粗酒精進(jìn)塔口以上2-4塊塔板收集雜醇油（異戊醇等多種高級醇），頭級雜質(zhì)：醛及低沸點酯（乙酸乙酯、甲酸乙酯等）從塔頂排出進(jìn)入預(yù)熱器，部分經(jīng)冷卻回流到精餾塔，再經(jīng)過冷卻器冷卻再回流，沒有被冷卻的從排醛塔外排。塔頂下4-6塊塔板（78℃）蒸汽經(jīng)冷卻得成品酒精濃度＞95.5%

六

發(fā)酵產(chǎn)物的精制1結(jié)晶技術(shù)1.1基本概念：結(jié)晶是一個重要的化工單元操作，在氨基酸工業(yè)、有機(jī)酸工業(yè)、核苷酸工業(yè)、酶制劑工業(yè)和抗生素工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用，結(jié)晶過程具有高度選擇性，只有同類分子或離子才能結(jié)合成晶體，因此，結(jié)晶是制備純物質(zhì)的有效方法。

結(jié)晶所形成的結(jié)晶形物質(zhì)構(gòu)成單位（原子、分子或離子）排列方式是規(guī)則的，如：氨基酸、檸檬酸、食鹽等。而沉淀所形成的物質(zhì)構(gòu)成單位排列方式是不規(guī)則的，如淀粉、酶制劑等。

1.2

結(jié)晶過程：溶質(zhì)從溶液結(jié)晶出來，要經(jīng)過兩個步驟：a.首先是產(chǎn)生晶核；b.然后是晶核在良好的環(huán)境中長大。

過飽和度的大小會影響晶核的形成速度和晶體的長大速度，這兩個速度又影響最終晶體產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，大生產(chǎn)中，過飽和度是工業(yè)上考慮問題的一個極其重要的因素。1.3晶體純度的影響因素：a.母液在晶體表面的吸藏（Occlusion)從結(jié)晶溶液（晶漿）中分離出結(jié)晶晶體后的溶液稱為母液。吸藏是指母液中雜質(zhì)吸附于晶體表面，如果晶體成長過快，雜質(zhì)甚至?xí)C(jī)械地陷入晶體，吸藏的雜質(zhì)可以通過重結(jié)晶的方式除去。b.形成晶蔟，包藏（Inclusion)母液細(xì)小的晶體易形成晶蔟，而晶蔟中常包藏母液。晶體的粒度大且較均勻的晶體所夾帶的母液較少，洗滌也比較容易。粒度小而且顆粒參差不齊，所夾帶的母液較多。c.晶習(xí)晶體的外形叫晶習(xí)。如谷氨酸結(jié)晶，存在兩種晶形：α-結(jié)晶（體）和β-結(jié)晶（體）。α-結(jié)晶呈顆粒狀，晶體產(chǎn)品質(zhì)量好；β-結(jié)晶呈片狀、針狀，比表面積大，易包含雜質(zhì)和母液。1.4發(fā)酵工業(yè)中常用的結(jié)晶方法：1.4.1等電點結(jié)晶：調(diào)節(jié)溶液的pH接近等電點，使溶質(zhì)結(jié)晶析出，等電點等電點結(jié)晶是氨基酸提取常用的方法。

1.4.2將熱飽和溶液冷卻，添加晶種結(jié)晶：此法適用于溶解度隨溫度下降而顯著減小的發(fā)酵產(chǎn)品，如：谷氨酸、檸檬酸等。1.4.3濃縮結(jié)晶：將部分溶媒蒸發(fā)使溶液達(dá)到過飽和而結(jié)晶，適用于溶解度隨溫度變化不顯著的發(fā)酵產(chǎn)品的結(jié)晶。如制霉菌素經(jīng)減壓真空濃縮、冷卻結(jié)晶。

1.4.4鹽析結(jié)晶：此法是添加一種物質(zhì)于溶液中，以使溶質(zhì)的溶解度降低，形成過飽和溶液而結(jié)晶的方法，通常成為鹽析法。這種物質(zhì)可以是有機(jī)溶劑或能溶于水的物質(zhì)，加入有機(jī)溶劑必須與原溶劑互溶。如：卡那霉素加95%乙醇，終濃度60%—80%時，即得結(jié)晶。2色譜分離2.1概述：色譜分離（chromatographicResolution,CR)

亦稱色層分離或?qū)游龇蛛x，在分析檢測中則常稱為色譜分析（chromatographicanalysis,CA)。它是一種物理的分離方法。利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)（如吸附力、分子極性、分子形狀和大小、分子親和力、分配系數(shù)等）的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個為固定相，另一個為流動相。從而使各組分分離。色譜分離的特點：分離效率高，應(yīng)用范圍廣，選擇性強(qiáng)，高靈敏度的在線檢測，快速分離，過程自動化。2.2

色譜分離的原理和分類：按照溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機(jī)理不同，色譜分離可大致分為五大類。2.2.1吸附色譜分離：吸附色譜（adsorptionchromatography,AC)

是指混合物隨流動相通過固定相（吸附劑）時，由于固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離的方法。吸附色譜是各種色譜分離技術(shù)中應(yīng)用最早的一類，傳統(tǒng)的吸附色譜以各種無機(jī)材料為吸附劑，如：氧化鋁、硅膠等，現(xiàn)在所用的吸附劑一般為有機(jī)基質(zhì)并通過化學(xué)修飾后制成。2.2.2分配色譜：分配色譜（distributionchromatography,DC)的流動相和固定相都是液體，因而又稱液-液色譜，其原理是利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。2.2.3離子交換色譜：離子交換色譜（ionexchangechromatography,IEC)

是基于離子交換樹脂上可電離的離子與具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，由于混合物中不同溶質(zhì)對交換劑具有不同的親和力而將它們分離。該法適合于離子和在溶劑中可發(fā)生電離的物質(zhì)的分離。廣泛用于生物大分子的分離純化，特別是蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物物質(zhì)的分離純化。

2.2.4凝膠色譜：凝膠色譜（gelchromatography,GC)

以凝膠為固定相，是一種根據(jù)各物質(zhì)分子的大小不同而進(jìn)行分離的色譜技術(shù)，因而又稱為分子篩色譜（molecularsievechromatography,MSC)，空間排阻色譜或尺寸排阻色譜。凝膠是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，凝膠的每一個顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)就如同一個篩子。較大的分子不能進(jìn)入凝膠的網(wǎng)孔而受到排阻，較小的分子能進(jìn)入部分凝膠網(wǎng)孔，流出的速度較慢，更小的分子進(jìn)入全部網(wǎng)孔，最后從凝膠柱中流出。

2.2.5親和色譜：親和色譜（affinitychromatography,AFC)作為色譜分離技術(shù)的一個分支，對于生物大分子化合物的分離純化具有特別重要的意義。生物體中許多大分子化合物具有與其結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性，如酶蛋白與輔酶、抗原與抗體、激素與其受體等體系，生物分子間的這種專一結(jié)合能力稱親和力。如果把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，即可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來。2.3柱色譜分離操作：發(fā)酵工業(yè)的色譜分離大多采用柱色譜分離法，而且吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜等都可在柱中進(jìn)行，它們的實驗裝置和操作方法也基本類似。2.3.1層析劑：用于色譜分離技術(shù)中的固定相或分離介質(zhì)，總稱為層析劑，它由基質(zhì)和表面活性功能基團(tuán)（活動中心）組成。層析劑的基質(zhì)材料應(yīng)為化學(xué)惰性材料與目的產(chǎn)物和雜質(zhì)都無結(jié)合作用，并應(yīng)具有下列特性：

a.不溶于流動相，且具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度；能經(jīng)受使用、清洗和再生時的各種環(huán)境條件；能耐受生物降解。

b.具有較大的表面積和孔隙度，且粒度、孔徑分布均勻。

c.有較高的回收率和負(fù)載量，能達(dá)到所需的分離效率，且重復(fù)性好。

d.有些分離過程，層析劑使用前后需要高壓消毒，此時層析劑應(yīng)具有較好的熱穩(wěn)定性。

e.無毒性，分離過程不引起目的產(chǎn)物的變性或失活。

f.成本較低，價格合理。無機(jī)基質(zhì)層析劑：硅膠、氧化鋁、活性炭、多孔玻璃等，有機(jī)基質(zhì)層析劑：瓊脂糖：是D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖交替結(jié)合而成的鏈狀多糖，是分離生物大