微生物的保藏技術(shù)

微生物的保藏方法

主要內(nèi)容常用的保藏方法1保藏原理2本卷須知3菌種保藏的緣由經(jīng)過(guò)分別純化得到的微生物純培育物，還必需經(jīng)過(guò)各種保藏技術(shù)使其在一定時(shí)間內(nèi)不死亡，不會(huì)被其他微生物污染，不會(huì)因發(fā)生變異而喪失重要的生物學(xué)性狀，否那么就無(wú)法真正保證微生物研討和運(yùn)用任務(wù)的順利進(jìn)展。菌種保藏就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。菌種保藏原理根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工發(fā)明的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞根本處于休眠形狀，生長(zhǎng)繁衍遭到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、枯燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。低溫、枯燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。美國(guó)規(guī)范生物保藏中心ATCC是美國(guó)規(guī)范生物品收藏中心。ATCC的成立可追溯到1925年，一個(gè)科學(xué)委員會(huì)認(rèn)識(shí)到科學(xué)研討對(duì)于微生物的大量需求而萌生了創(chuàng)建一個(gè)微生物相關(guān)制品供應(yīng)中心的想法。ATCC以生命科學(xué)領(lǐng)域全方位知識(shí)的獲取，分類(lèi)，匯總，完善進(jìn)而廣泛傳播為己任，以期為推進(jìn)生物原料，生物信息，生物技術(shù)，知識(shí)產(chǎn)權(quán)，規(guī)范等相關(guān)領(lǐng)域的前沿性、合法化、適用性發(fā)揚(yáng)一定的作用。ATCC擁有目前世界上最大的、種類(lèi)最豐富的微生物、細(xì)胞系以及重組DNA原料，同時(shí)它也是科研任務(wù)者公認(rèn)的提供世界級(jí)的可靠的研討資料的供應(yīng)商。美國(guó)規(guī)范生物保藏中心美國(guó)典型微生物菌種保藏中心,AmericanTypeCultureCollection(ATCC)

ATCC主要從事農(nóng)業(yè)、遺傳學(xué)、運(yùn)用微生物、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、工業(yè)微生物學(xué)、菌種保藏方法、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、植物病理學(xué)、普通微生物學(xué)、分類(lèi)學(xué)、食品科學(xué)等的研討。

該中心保藏有藻類(lèi)111株，細(xì)菌和抗生素16865株，細(xì)胞和雜合細(xì)胞4300株，絲狀真菌和酵母46000株，植物組織79株，種子600株，原生動(dòng)物1800株，動(dòng)物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。另外，該中心還提供菌種的分別、鑒定及保藏效力。該中心保藏的菌種可出賣(mài)。

中國(guó)菌種保藏管理中心中國(guó)菌保會(huì)是國(guó)際認(rèn)可的菌種保藏機(jī)構(gòu)，下設(shè)7個(gè)全國(guó)性菌種保藏管理中心：〔1〕普通微生物菌種保藏管理中心；〔2〕農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；〔3〕工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；〔4〕醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心；〔5〕抗生素菌種保藏管理中心；〔6〕獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；〔7〕林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。〔1984年添加〕

中國(guó)規(guī)范生物保藏中心我國(guó)獨(dú)一的國(guó)家級(jí)工業(yè)微生物菌種資源保藏管理中心，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)和國(guó)際菌種保藏結(jié)合會(huì)成員之一，隸屬于中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研討院，專(zhuān)業(yè)從事工業(yè)微生物菌種資源保藏管理的公益根底性資源保藏機(jī)構(gòu)，擔(dān)任全國(guó)工業(yè)消費(fèi)與研討運(yùn)用微生物菌種資源的搜集、整理、鑒定、保藏、供應(yīng)與國(guó)際交流。中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心〔CICC〕保藏各種工業(yè)微生物菌種資源包括：細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌和大型真菌，共67個(gè)屬251種，近3000株，庫(kù)藏備份80000余支。中國(guó)規(guī)范生物保藏中心中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心AgriculturalCultureCollectionofChin〔ACCC〕

ACCC是中國(guó)國(guó)家級(jí)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理專(zhuān)門(mén)機(jī)構(gòu),擔(dān)任全國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種的搜集、鑒定、評(píng)價(jià)、保藏、供應(yīng)及國(guó)際交流義務(wù).庫(kù)藏菌種2490株,其中細(xì)菌1004株,放線菌69株,絲狀真菌355株,酵母菌124株,食用菌582.

中國(guó)規(guī)范生物保藏中心中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心成立〔英文縮寫(xiě)：CGMCC，設(shè)立在中國(guó)科學(xué)院微生物研討所〕1985年，開(kāi)場(chǎng)用于專(zhuān)利程序的微生物保管1995年，獲得布達(dá)佩斯條約國(guó)際保藏中心〔IDA〕的資歷1995年，參與中國(guó)科學(xué)院典型培育物保藏委員會(huì)目的和義務(wù)。作為一個(gè)非贏利性、公益性、效力性技術(shù)支撐機(jī)構(gòu)，CGMCC的目的是廣泛搜集國(guó)內(nèi)外的微生物資源，妥善保管，以公開(kāi)的保藏機(jī)構(gòu)的名義為工農(nóng)業(yè)消費(fèi)、衛(wèi)生安康、環(huán)境維護(hù)、科研教育提供規(guī)范化的實(shí)驗(yàn)資料,在保證生物平安和維護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的前提下，為第三者可以自在地利用各種微生物資料提供效力，最大限制的實(shí)現(xiàn)微生物資源的維護(hù)、共享和繼續(xù)利用。德國(guó)與韓國(guó)規(guī)范生物保藏中心德國(guó)微生物菌物保藏中心(DSMZ)，保藏有9400種細(xì)菌、2400種真菌、500種酵母菌、300種質(zhì)粒、500種動(dòng)物細(xì)胞、500種植物細(xì)胞、170種動(dòng)物雜腫瘤、600種植物病毒、90種細(xì)菌病毒等〔德文，英文〕。韓國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研討所——農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏〔KACC〕，保藏有細(xì)菌890種、真菌1581種、酵母菌62種、cDNA600種〔英文〕。

法國(guó)規(guī)范生物保藏中心法國(guó)國(guó)家歷史自然博物館——Algothequedu實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心

AlgothequeduLaboratoiredeCryptogamie,MuseumNationald'HistoireNaturelle〔ALCP〕

ALCP隸屬于法國(guó)國(guó)家歷史自然博物館，主要從事于工業(yè)微生物學(xué)，運(yùn)用微生物學(xué)，微生物系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)，培育和保藏方法等方面的研討，以及藻類(lèi)等微生物的分別，鑒定，保藏任務(wù)。保藏有藻類(lèi)600種、細(xì)菌200種。該中心保藏的菌種可出賣(mài)。

各國(guó)規(guī)范生物保藏中心法國(guó)巴斯德研討所L'InstitutPasteur菌物保藏中心

CollectiondeL'InstitutPasteurOfInstitutPasteur(CIP)

加拿大國(guó)家微生物安康實(shí)驗(yàn)室微生物菌種保藏中心

NationalMicrobiologyLaboratoryHealthCanadaCultureCollections〔NML-HCCC〕

日本生物技術(shù)研討所微生物菌種保藏中心

MarineBiotechnologyInstituteCultureCollection,MarineBiotechnologyInstituten(MBIC)

傳代培育保藏一、傳代培育保藏原理1優(yōu)缺陷2本卷須知3傳代培育的原理有些微生物當(dāng)遇到冷凍或枯燥等處置時(shí)，會(huì)很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培育保管法。傳代培育就是要定期地進(jìn)展菌種轉(zhuǎn)接、培育后再保管，它是最根本的微生物保管法，例如酸奶等常用消費(fèi)菌種的保管。

傳代培育優(yōu)缺陷傳代培育保管法雖然簡(jiǎn)便，但其缺陷也很明顯，如：①菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉；②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異；③反復(fù)傳代時(shí)，菌株的病原性、構(gòu)成生理活性物質(zhì)的才干以及構(gòu)成孢子的才干等均有降低；④需求定期轉(zhuǎn)種，任務(wù)量大；⑤雜菌的污染時(shí)機(jī)較多。

傳代培育的本卷須知傳代保管時(shí)，培育基的濃度不宜過(guò)高，營(yíng)養(yǎng)成分不宜過(guò)于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在能夠的范圍內(nèi)盡量降低。培育溫度通常以稍低于最適生長(zhǎng)溫度為好。假設(shè)為產(chǎn)酸菌種，那么應(yīng)在培育基中添加少量碳酸鈣。

普通地，大多數(shù)菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種那么可以運(yùn)用37℃進(jìn)展保管，而蕈類(lèi)等大型食用菌的菌種那么可以室溫直接保管。二、冷凍保藏原理

適用于抗凍力強(qiáng)的微生物。這些微生物可在其菌體細(xì)胞外蒙受凍結(jié)的情況下而不受損傷，而對(duì)其它大多數(shù)微生物而言，無(wú)論在細(xì)胞外凍結(jié)還是在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)，都會(huì)對(duì)菌體呵斥損傷，使其代謝作用停頓，可到達(dá)保藏的目的。常用的冷凍保藏法液氮保藏法1低溫冰箱保管法2干冰保管法3液氮保管法一、適用范圍液氮溫度在-196以下,用于快速制冷,速凍,機(jī)械安裝等,普通不用于日常生活,此法除適宜于普通微生物的保藏外，對(duì)一些用冷凍枯燥法都難以保管的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以構(gòu)成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長(zhǎng)期保藏，而且性狀不變異。缺陷是需求特殊設(shè)備。二、保藏方法a、裝安瓶管：運(yùn)用盡量濃重的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑〔保管霉菌不用防凍劑〕的滅菌溶液中，將0.2～1ml的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。b、熔封安瓶管：假設(shè)直接儲(chǔ)存于氣相液氮中〔－150℃～－170℃〕時(shí)，那么不需熔封。c、檢查安瓶管能否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳厝芤褐薪?～30分鐘后，察看有無(wú)色素進(jìn)入安瓶。d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮?dú)庖约s1℃/min的速度冷卻至－25℃左右，也可在－20℃～－25℃的冰箱內(nèi)緩慢冷卻30～60min。e、速冷：最后浸入液氮中快速冷卻至－196℃。

這種方法適用范圍廣，而且是目前常用的較理想的，繁而高效。保藏期2~3年，甚至長(zhǎng)達(dá)9年。低溫冰箱保管法一、適用范圍－20℃、－50℃或－85℃二、保藏方法低溫冷凍保管時(shí)運(yùn)用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保管時(shí)菌液加量不宜過(guò)多，有些可添加維護(hù)劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來(lái)吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi)，再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)展保管的。干冰保管法一、適用范圍－70℃左右二、保藏方法將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進(jìn)展冷凍保管。菌種保藏的共同留意點(diǎn)：1、嚴(yán)厲的無(wú)菌操作；2、用于保管的微生物在生長(zhǎng)前必需處于它生長(zhǎng)良好的形狀；3、保藏過(guò)程中要防止退化的發(fā)生〔不同的保藏方法，分別有不同的保管時(shí)間?！潮揪眄氈僖x擇適于冷凍枯燥的菌齡細(xì)胞；②要選擇適宜的培育基，由于某些微生物對(duì)冷凍的抵抗力，常隨培育基成分的變化而顯示出宏大差別；③要選擇適宜的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保管期也越長(zhǎng)；④最好在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)〔如食鹽等〕；⑤可在菌液內(nèi)添加甘油〔甘油管冷凍保藏法〕等維護(hù)劑，以防止在冷凍過(guò)程中出現(xiàn)菌體大量死亡的景象。同樣，也可添加各種糖類(lèi)、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好維護(hù)效果的溶劑，但對(duì)有些微生物而言，不加維護(hù)劑時(shí)更有效。⑥原那么上應(yīng)盡快進(jìn)展冷凍處置，但當(dāng)參與維護(hù)劑時(shí)，可靜置一段時(shí)間后再進(jìn)展處置。⑦就動(dòng)物細(xì)胞而言，應(yīng)在－20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度緩慢降溫，以后必需盡快降到貯藏溫度；而對(duì)絕大多數(shù)微生物而言，那么不用如此，如構(gòu)造較為復(fù)雜的原蟲(chóng)那么可在－35℃范圍內(nèi)進(jìn)展緩慢降溫，而噬菌體那么必需采用上述的二階段法進(jìn)展冷凍；⑧假設(shè)進(jìn)展長(zhǎng)期保管，那么貯藏溫度越低越好；⑨取用冷凍保管的菌種時(shí)，應(yīng)采取速融措施，即在35～40℃溫水中悄然振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來(lái)說(shuō)，那么應(yīng)選擇靜置融化的措施。當(dāng)冷凍菌融化后，應(yīng)盡量防止再次冷凍，否那么菌體的存活率將顯著下降?？傊?，首先堅(jiān)持原菌優(yōu)良性狀長(zhǎng)期穩(wěn)定，同時(shí)思索方法的通用性、操作的簡(jiǎn)便性和設(shè)備的普及性。三、枯燥保藏法1、沙土管保管2、冷凍真空保藏沙土管保管1、主要用于能構(gòu)成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏，如：芽孢桿菌、放線菌等。2、方法：將菌種接種斜面，培育至長(zhǎng)出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸液，參與無(wú)菌的沙土管中，減壓枯燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、膠塞等封鎖管口，置冰箱保管。沙土管保藏：用棉塞塞住安瓿管，放在可以抽真空的枯燥器中，然抽干后將真空枯燥器的旋塞封鎖即可。不用火焰封口，用時(shí)將真空枯燥器放氣翻開(kāi)取出，剩余的繼續(xù)抽真空，抽至真空后封鎖旋塞保藏即可。此法簡(jiǎn)單易行，并可以將微生物保藏較長(zhǎng)時(shí)間，適宜普通實(shí)驗(yàn)室及以放線菌等為菌種的發(fā)酵工廠采用。冰凍真空保藏原理是首先將加有維護(hù)劑的細(xì)胞樣品先預(yù)冷，使其凍結(jié)，然后在減壓下利用升華景象除去水分?，F(xiàn)實(shí)上，從菌體中除去大部分水分后，細(xì)胞的生理活動(dòng)就會(huì)停頓，因此可以到達(dá)長(zhǎng)期維持生命形狀的目的。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種〔包括噬菌體和立克次氏體等〕的保管。

到達(dá)枯燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保管，從而使微生物處于枯燥、缺氧及低溫的形狀，生命活動(dòng)處于休眠，可以到達(dá)長(zhǎng)期保藏的目的。用冰升華的方式除去水分，手段比較溫暖，細(xì)胞受損傷的程度相對(duì)較小，存活率及保藏效果均不錯(cuò)，而且經(jīng)抽真空封