實(shí)驗(yàn)二葉綠素的提取與分離

實(shí)驗(yàn)二葉綠素的提取與分離實(shí)驗(yàn)二葉綠素的提取和分離一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膹母缓~綠素的菠菜葉片中提取葉綠素，并在薄層層析板上點(diǎn)樣使葉綠素顯示不同顏色。二實(shí)驗(yàn)原理要求同學(xué)們先查詢資料，了解葉綠素相關(guān)知識(shí)，實(shí)驗(yàn)課上老師講解。三、 實(shí)驗(yàn)材料、器具研缽、托盤天平、分液漏斗、干燥錐形瓶、毛細(xì)管、薄層層析板、^和NaCl溶液、無水Na2SO4四、 實(shí)驗(yàn)步驟1、 葉綠素的提取在中放入幾片（約5g）菠菜葉（新鮮的或冷凍的都可以.如果是冷凍的，解凍后包在紙中輕壓吸左水分）。加入10mL2:1石油醚和丙酮混合液，適當(dāng)研磨。將提取液用滴管轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入10mL飽和NaCl溶液（防止生成乳濁液）除去水溶性物質(zhì)，分去H2O層，再用蒸餾水洗滌兩次。將有機(jī)層轉(zhuǎn)入干燥的小錐形瓶中，加2g無水Na2SO4,通風(fēng)處理。處理后的液體傾至另一錐形瓶中伎口溶液顏色太淺，可在通風(fēng)柜中適當(dāng)蒸發(fā)濃縮）。2、 點(diǎn)樣用一根內(nèi)徑1mm的毛細(xì)管，吸取適量提取液，輕輕地點(diǎn)在距薄板一端1cm處，平行點(diǎn)兩點(diǎn)，兩點(diǎn)相距1cm左右。若一次點(diǎn)樣不夠，可待樣品溶劑揮發(fā)后.再在原處點(diǎn)第二次，但點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑不得越過2mm。3、 展開先在小燒杯中放入展開劑［用石油醚和丙酮按3:1的比例進(jìn)行混合作為展開劑，再將薄層板斜靠于層析缸內(nèi)壁。點(diǎn)樣端接觸展開劑但樣點(diǎn)不能浸沒于展開劑中，密閉層析缸。待展開劑上升到距薄層板另一端約1cm時(shí)，取出平放，用鉛筆或小針劃前沿線位置，在空氣中晾干或用電吹風(fēng)吹干薄層。毛細(xì)管點(diǎn)樣薄層色譜展開4、觀察層析板并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。薄層層析時(shí)Rf值表示的是原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離與原點(diǎn)的到展層溶劑的前沿距離包括擴(kuò)散最快的是什么，擴(kuò)散最慢的是什么最寬的色素帶是什么，最窄的色素帶是什么哪兩個(gè)色素帶距離相距最遠(yuǎn)，哪兩個(gè)最近等等各種色素在層析液中的溶解度不同，溶解度高的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散的快，反之則慢。最快：胡蘿卜素次之：葉黃素次之：葉綠素A最慢：葉綠素B顏色分別為：橙黃色、黃色、藍(lán)綠色和黃綠色，最寬的是葉綠素A最窄的是胡蘿卜素胡蘿卜素和葉綠素B最遠(yuǎn)葉綠素A和葉綠素8最近實(shí)驗(yàn)十四、植物色素的提取和薄層色譜分析一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、 了解薄層色譜的基本原理和應(yīng)用。2、 掌握薄層色譜的操作技術(shù)。二、 實(shí)驗(yàn)原理：1、原理薄層色譜（ThinLayerChromatography）常用TLC表示，又稱薄層層析，屬于固-液吸附色譜。樣品在薄層板上的吸附劑（固定相）和溶劑（移動(dòng)相）之間進(jìn)行分離。由于各種化合物的吸附能力各不相同，在展開劑上移時(shí)，它們進(jìn)行不同程度的解吸，從而達(dá)到分離的目的。2、 薄層色譜的用途：1） 化合物的定性檢驗(yàn)。（通過與已知標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)比的方法進(jìn)行未知物的鑒定）在條件完全一致的情況，純碎的化合物在薄層色譜中呈現(xiàn)一定的移動(dòng)距離，稱比移值（Rf值），所以利用薄層色譜法可以鑒定化合物的純度或確定兩種性質(zhì)相似的化合物是否為同一物質(zhì)。但影響比移值的因素很多，如薄層的厚度，吸附劑顆粒的大小，酸堿性，活性等級(jí)，夕卜界溫度和展開劑純度、組成、揮發(fā)性等。所以，要獲得重現(xiàn)的比移值就比較困難。為此，在測(cè)定某一試樣時(shí)，最好用已知樣品進(jìn)行對(duì)照。距離溶劑前沿至原點(diǎn)中心的點(diǎn)中心的距離溶質(zhì)最高濃度中心至原fR2） 快速分離少量物質(zhì)。（幾到幾十微克，甚至四）3） 跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，常利用薄層色譜觀察原料斑點(diǎn)的逐步消失，來判斷反應(yīng)是否完成。4） 化合物純度的檢驗(yàn)（只出現(xiàn)一個(gè)斑點(diǎn)，且無拖尾現(xiàn)象，為純物質(zhì)。）此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。3、 色譜法色譜法是與植物天然色素的分離提取同時(shí)發(fā)展起來的.色譜法（紙色譜，薄層色譜和柱色譜）至今仍然是分離葉綠素等天然色素最有效的方法。色譜法分離葉綠體色素的基本原理是利用不同色素在各種有機(jī)溶劑中的分配系數(shù)，或在吸附劑上的吸附能力的不同，當(dāng)它們通過色譜柱/床時(shí),這種分配或吸附過程反復(fù)多次地進(jìn)行，最后將它們一一分離開來。通常認(rèn)為,紙色譜屬于分配色譜.它是以濾紙為惰性支持物，濾紙纖維一般能吸收約20%的水分,其中有6~7%以氫鍵形式與纖維素上的羥基結(jié)合,構(gòu)成紙色譜的固定相.在展開過程中，被分離組分在展開劑和固定相之間不斷進(jìn)行分配,龍巖學(xué)院分析化學(xué)精品課程分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目指導(dǎo)書2達(dá)到相互分離.薄層色譜和柱色譜的吸附劑(固定相)有硅膠，氧化鋁,硅藻土等無機(jī)物，也有糖類，纖維素,聚酰胺,C18和離子交換樹脂等有機(jī)物.它們的分離機(jī)理也各不相同,如吸附，分配，氫鍵，正相和反相色譜等。對(duì)于紙色譜或薄層色譜，毛細(xì)管作用是推動(dòng)溶劑展開的動(dòng)力.被分離物質(zhì)在圖譜上的位置，可用比移值Rf表示Rf二原點(diǎn)至斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)至展開劑前沿的距離。植物光合作用是自然界最重要的現(xiàn)象，它是人類所利用能量的主要來源在把光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的光合作用過程中,葉綠體色素起著重要的作用.高等植物體內(nèi)的葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素兩類，主要包括葉綠素a,葉綠素b，8胡蘿卜素和葉黃素四種.葉綠素(chlorophylls)是葉綠酸的酯，它在植物進(jìn)行光合作用中吸收可見光并將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能.葉綠素是植物進(jìn)行光合作用所必需的催化劑.在綠色植物中葉綠素主要以葉綠素a(C55H72O5N4Mg)和葉綠素b(C55H70O6N4Mg)兩種結(jié)構(gòu)相似的形式存在其差別僅是葉綠素a中一個(gè)甲基被葉綠素b中的甲?；〈?。三、 實(shí)驗(yàn)裝置四、 實(shí)驗(yàn)操作步驟和內(nèi)容：(一)步驟1、吸附劑的選擇薄層色譜的吸附劑最常用的是氧化鋁和硅膠。1）、硅膠：“硅膠寸一不含粘合劑；“硅膠G''一含煅石膏粘合劑；其顆粒大小一般為260目以上。顆粒太大，展開劑移動(dòng)速度快，分離效果不好；反之，顆粒太小，溶劑移動(dòng)太慢，斑點(diǎn)不集中，效果也不理想?；衔锏奈侥芰εc它們的極性成正比，具有較大極性的化合物吸附較強(qiáng)，因而Rf值較小。酸和堿〉醇、胺、硫醇〉酯、醛、酮〉芳香族化合物〉鹵代物、醚〉烯〉飽和烴本實(shí)驗(yàn)選擇的吸附劑為薄層色譜用硅膠G。龍巖學(xué)院分析化學(xué)精品課程分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目指導(dǎo)書32、 薄層板的制備（濕板的制備）薄層板制備的好壞直接影響色譜的結(jié)果。薄層應(yīng)盡量均勻且厚度要固定。否則，在展開時(shí)前沿不齊，色譜結(jié)果也不易重復(fù)。在燒杯中放入2g硅膠G，加入5—6ml%的羧甲基纖維素鈉水溶液，調(diào)成糊狀。將配制好的漿料傾注到清潔干燥的載玻片上，拿在手中輕輕的左右搖晃，使其表面均勻平滑，在室溫下晾干后進(jìn)行活化。本實(shí)驗(yàn)用此法制備薄層板4片。3、 薄層板的活化將涂布好的薄層板置于室溫涼干后，放在烘箱內(nèi)加熱活化，活化條件根據(jù)需要而定。硅膠板一般在烘箱中漸漸升溫，維持105—1101活化30min。氧化鋁板在2001烘4h可得到活性為H級(jí)的薄板，在150—1601烘4h可得活性為B—IV級(jí)的薄板。活化后的薄層板放在干燥器內(nèi)保存待用。4、 點(diǎn)樣先用鉛筆在距薄層板一端1cm處輕輕劃一橫線作為起始線，然后用毛細(xì)管吸取樣品，在起始線上小心點(diǎn)樣，斑點(diǎn)直徑一般不超過2mm。若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點(diǎn)樣，但應(yīng)待前次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點(diǎn)樣，以防樣點(diǎn)過大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，而影響分離效果。若在同一板上點(diǎn)幾個(gè)樣，樣點(diǎn)間距離應(yīng)為1。點(diǎn)樣要輕，不可刺破薄層。5、 展開薄層色譜的展開，需要在密閉容器中進(jìn)行。為使溶劑蒸氣迅速達(dá)到平衡，可在展開槽內(nèi)襯一濾紙。在層析缸中加入配好的展開溶劑，使其高度不超過1cm。將點(diǎn)好的薄層板小心放入層析缸中，點(diǎn)樣一端朝下，浸入展開劑中。蓋好瓶蓋，觀察展開劑前沿上升到一定高度時(shí)取出，盡快在板上標(biāo)上展開劑前沿位置。晾干，觀察斑點(diǎn)位置，計(jì)算Rf值。分離葉綠體色素的展開劑有:石油醚(60~90。。-丙酮-乙醚(3:1:1);石油醚-丙酮(8:2);石油醚-乙酸乙酯(6:4);苯-丙酮(7:3)和石油醚(30?60。)-丙酮-正丁醇(90:10:等.本實(shí)驗(yàn)將150mL石油醚(60~90。)-丙酮-乙醚(3:1:1)展開劑倒入層析缸中，并在層析缸的內(nèi)壁四周貼一張5cm高的濾紙，濾紙下部浸在展開劑中,蓋好蓋子平衡10~15min.將點(diǎn)好樣的硅膠板放入展開缸里液面不能超過點(diǎn)樣線蓋好蓋子進(jìn)行上行層析.待展開劑前沿上升到距硅膠板上端~2cm時(shí)，取出硅膠板置于通風(fēng)櫥里晾干，可看到層析板上出現(xiàn)若干色素帶其排列順序一般是8-胡蘿卜素，去鎂葉綠素，葉綠素a,葉綠素b和葉黃素等多條色帶.用鉛筆標(biāo)記出樣品斑點(diǎn)，計(jì)算各色素的比移值Rf.6、 顯色被分離物質(zhì)如果是有色組分，展開后薄層色譜板上即呈現(xiàn)出有色斑點(diǎn)。如果化合物本身無色，則可用碘蒸氣熏的方法顯色。還可使用腐蝕性的顯色劑如濃硫酸、濃鹽酸和濃磷酸等。對(duì)于含有熒光劑的薄層板在紫外光下觀察，展開后的有機(jī)化合物在亮的熒龍巖學(xué)院分析化學(xué)精品課程分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目指導(dǎo)書4光背景上呈暗色斑點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)樣品本身具有顏色，不必在熒光燈下觀察。7、 樣品收集將層析板上分開的8-胡蘿卜素，葉綠素a,葉綠素b的色帶分別用干凈的刮刀刮入試管中，加入5mL丙酮提取，低溫避光保存.8大、溫度對(duì)薄層色譜分離的影響取兩塊1x5cm2的商品硅膠板點(diǎn)樣后，以相同的展開劑，分別置于冰箱（4。。和室溫（20^以上）展開.觀察和對(duì)比它們的分離結(jié)果.（二）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：（以下實(shí)驗(yàn)內(nèi)容選做其一）1、檢驗(yàn)甲基橙的純度。（通過與已知標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)比的方法檢驗(yàn)物質(zhì)是否純凈）實(shí)驗(yàn)樣品：甲基橙粗品（自制）、甲基橙純品。溶劑：乙醇：水=1:1展開劑：丁醇：乙醇：水=10:1:12、 混合物的分離實(shí)驗(yàn)樣品：圓珠筆芯油溶劑：95%乙醇展開劑：丁醇：乙醇：水=9：3：1（體積比）3、 1%偶氮苯、1%間硝基苯胺、熒光黃（95%乙醇，1mg/1ml）、次甲基藍(lán)、環(huán)己烷:乙酸9:14、 植物色素8-胡蘿卜素，去鎂葉綠素，葉綠素a,葉綠素b和葉黃素的提取與分離。五、 實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵步驟：1、 載玻片應(yīng)干凈且不被手污染，吸附劑在玻片上應(yīng)均勻平整。2、 點(diǎn)樣不能戳破薄層板面，各樣點(diǎn)間距1—1.5cm，樣點(diǎn)直徑應(yīng)不超過2mm。3、 展開時(shí)，不要讓展開劑前沿上升至底線。否則，無法確定展開劑上升高度，即無法求得Rf值和準(zhǔn)確判斷粗產(chǎn)物中各組分在薄層板上的相對(duì)位置。六、 思考題1、如何利用Rf值來鑒定化合物？答：在條件完全一致的情況，純碎的化合物在薄層色譜中呈現(xiàn)一定的移動(dòng)距離，稱比移值（Rf值），所以利用薄層色譜法可以鑒定化合物的純度或確定兩種性質(zhì)相似的化合物是否為同一物質(zhì)。但影響比移值的因素很多，如薄層的厚度，吸附劑顆粒的大小，酸堿性，活性等級(jí)，外界溫度和展開劑純度、組成、揮發(fā)性等。所以，要獲得重現(xiàn)的比移值就比較困難。為此，在測(cè)定某一試樣時(shí)，最好用已知樣品進(jìn)行對(duì)照。2、 薄層色譜法點(diǎn)樣應(yīng)注意些什么？答：（1）先用鉛筆在距薄層板一端1cm處輕輕劃一橫線作為起始線，然后用毛細(xì)管吸取樣品，在起始線上小心的點(diǎn)樣，斑點(diǎn)直徑一般不超過2mm。（2） 若因樣品溶液太稀，可以重復(fù)點(diǎn)樣，但應(yīng)待前次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點(diǎn)樣，以防樣點(diǎn)過大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，而影響分離效果。（3） 若在同一板上點(diǎn)幾個(gè)樣，樣點(diǎn)間距離應(yīng)為1-1.5cm。（4） 點(diǎn)樣要輕，不可刺破薄層。3、 常用的薄層色譜的顯色劑是什么？答：顯色凡可用于紙色譜的顯色劑都可用于薄層色譜。薄層色譜還可使用腐蝕性的顯色劑如濃硫酸、濃鹽酸和濃磷酸等。對(duì)于含有熒光劑（硫化鋅鎘、硅酸鋅、熒光黃）的薄層板在紫外光下觀察，展開后的有機(jī)化合物在亮的熒光背景上呈暗色斑點(diǎn)。也可用鹵素斑點(diǎn)試驗(yàn)法來使薄層色譜斑點(diǎn)顯色。4、 薄層板的展開方式有哪些？答：（1）上升法：將色譜板垂直于盛有展開劑的容器中，適合于含粘合劑的色譜板。（2） 傾斜上行法：色譜板傾斜10-15角；色譜板傾斜45-60角。（3） 下降法：用濾紙或紗布等將展開劑吸到薄層板的上端，使展開劑沿板下行，這種連續(xù)展開的方法適用于Rf值小的化合物。（4） 雙向色譜法：將樣品點(diǎn)在方形薄層板的角上，先向一個(gè)方向展開，然后轉(zhuǎn)動(dòng)90角的位置，再換另一種展開劑展開。適合于成分復(fù)雜的化合物分離。注意：展開時(shí)，不要讓展開劑前沿上升至底線。否則，無法確定展開劑上升高度，即無法求得Rf值和準(zhǔn)確判斷粗產(chǎn)物中各組分在薄層板上的相對(duì)位置。5、 硅膠G薄層如何涂布和活化？答：取硅膠G或硅膠GF-份，置燒杯中加水約5份混合均勻，放置片刻，隨即用藥匙取一定量，分別倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推動(dòng)涂布），均勻涂布成~0.5mm厚度，輕輕振動(dòng)玻璃板，使薄層面平整均勻，在水平位置放置，待薄層發(fā)白近干，于烘箱中100°C活化~1小時(shí)，冷后貯于干燥器內(nèi)備用。活化溫度和時(shí)間可依需要調(diào)整，一般檢識(shí)水溶性成分或一些極性大的成分時(shí)，所用薄層板只在空氣中自然干燥，不經(jīng)活化即可貯存?zhèn)溆谩?、 薄層色譜法有哪些優(yōu)點(diǎn)？答：薄層色譜法是一種高效、簡便的分離方法，其優(yōu)點(diǎn)是：快速，全過程只需10~60min（紙色譜法需幾小時(shí)到幾十小時(shí)）；分離效率高；靈敏度高，可檢出g的物質(zhì)；顯色的方法比紙色譜法多；應(yīng)用面廣。7、 薄層色譜法中展開劑、吸附劑是如何選擇的？答：薄層色譜法的固定相吸附劑顆粒要比柱色譜法細(xì)得多，其直徑一般為10~40。由于被分離的對(duì)象及所有展開劑的極性不同，應(yīng)選用活性不同的吸附劑作固定相，吸附劑的活性可分為I~V級(jí)，I級(jí)活性最強(qiáng)，V級(jí)的活性最弱。吸附劑和展開劑選擇的一般原則是：非極性組分的分離，選用活性強(qiáng)制吸附劑，用非極性展開劑；極性組分的分離，選用活性弱的吸附劑，用極性展開劑。實(shí)際工作中要經(jīng)過多次試驗(yàn)來確定。龍巖學(xué)院分析