仿刺參類硫氧還蛋白基因克隆、表達分析和功能驗證.x課件

仿刺參類硫氧還蛋白基因克隆、表達分析和功能驗證仿刺參具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值,是我國沿海最重要的養(yǎng)殖品種之一。然而,近年來,各個年齡段的仿刺參病害的大規(guī)模爆發(fā)對其養(yǎng)殖產業(yè)造成了嚴重威脅,深入研究刺參的抗病機制和有效防治途徑已經(jīng)成為當前仿刺參養(yǎng)殖基礎研究中的熱點。本文以仿刺參[Apostichopusjaponicus(Slenka)]為研究對象,通過RACE克隆技術獲得了仿刺參類硫氧還蛋白(AjTRX)基因的cDNA序列,運用熒光定量PCR技術研究了其在不同組織和燦爛弧菌(Vibriosplendidus)刺激后的表達情況;此外,參照基因工程技術表達和純化出了AjTRX基因的重組蛋白,并對其的活性進行了驗證;最后,通過RNA干擾技術研究了AjTRX基因與活性氧(ROS)生成量之間的關系。主要研究結果如下:1.本實驗結合轉錄組文庫的篩查結果和RACE克隆技術,首次得到了仿刺參AjTRX基因的cDNA全長。AjTRX基因的cDNA全長1870bp,由一個882bp的編碼293個氨基酸的開放閱讀框,一個101bp的5’非編碼區(qū)和一個887bp的3’非編碼區(qū)組成。AjTRX基因預測的氨基酸的分子量和等電點分別是32.3kDa和5.52。遺傳系統(tǒng)進化樹分析表明AjTRX基因與海膽親緣關系最近。因此,結果推測AjTRX可能和其他物種中的TRX同源物具有相同的生物學上的功能。通過實時定量PCR技術發(fā)現(xiàn)AjTRX基因在所有檢測的組織中均有表達,這些組織包括縱肌、體腔細胞、管足、腸、呼吸樹和體壁。在燦爛弧菌感染后,AjTRX基因在8小時在體腔細胞中的表達量為對照組的8.4倍,在48小時時為9.6倍,與對照組差異極顯著。這些結果表明AjTRX基因參與到了仿刺參應對燦爛弧菌感染后的免疫響應過程中。2.硫氧還蛋白(Thioredoxin,Trx)是氧化還原蛋白家族的重要一員。本研究中,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)結果表明,實驗成功地在大腸桿菌中得到了過表達的AjTRX基因的重組蛋白(rAJTRX)。此外,不同劑量的具有活性的rAJTRX表現(xiàn)出了明顯的抗氧化性,并且在20μM的實驗組中探測到了更高的還原性。這些結果表明AJTRX可能參與仿刺參的抗氧化反應并表現(xiàn)出很強的還原性。3.為了進一步探究AjTRX基因與ROS的關系,本研究通過RNA干擾技術在仿刺參體內、體外敲降AjTRX基因后,通過測定ROS的生成量來驗證AjTRX的抗氧化性。實驗結果顯示,仿刺參AjTRX基因體外干擾后,原代體腔細胞的ROS生成量上升了1.86倍;體內干擾后,體腔細胞的ROS生成量上升為對照組的1.62倍,與對照組差異極顯著。這些結果表明AjTRX基因可以負向調控ROS的生成量。本文的研究結果表明,AjTRX能夠作為一種抗氧化蛋白,在仿刺參的生理過程中起至關重要的作用。同時,AjTRX基因也很有可能參與了仿刺參應對燦爛弧菌的免疫