DNA測(cè)序分析常見(jiàn)問(wèn)題整理

AppliedBiosystems3730/3730xlDNAAnalyzersDNA測(cè)序分析常見(jiàn)問(wèn)題整理整理課件測(cè)序結(jié)果—峰圖四色圖譜：每一種顏色對(duì)應(yīng)一種堿基ATCG整理課件

引物DNA模板純化困難模板機(jī)器影響影響測(cè)序質(zhì)量的主要因素整理課件一、引物對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響①引物合成時(shí)多〔少〕一個(gè)堿基②引物不純③模板上沒(méi)有引物結(jié)合位點(diǎn)④引物二聚體⑤雙引物結(jié)合整理課件合成時(shí)部分引物多一個(gè)堿基合成時(shí)部分引物少一個(gè)堿基●現(xiàn)象：每個(gè)峰后面有個(gè)同樣熒光信號(hào)的小“尾巴〞?！裨颍汉铣蓵r(shí)引物多一個(gè)堿基?！駥?duì)策：重新合成引物●現(xiàn)象：每個(gè)峰前面有個(gè)同樣熒光信號(hào)的小“尾巴〞?！裨颍汉铣蓵r(shí)引物多一個(gè)堿基?！駥?duì)策：重新合成引物整理課件引物〔模板〕不純●現(xiàn)象：整個(gè)峰圖噪音都比較高?！矃^(qū)別與小片段的干擾〕●原因：引物〔模板〕純度太低，含有較多雜質(zhì)●對(duì)策：–建議使用HPLC〔柱子純化〕或PAGE純化的測(cè)序引物。–脫鹽純化的引物純度較低，適合做普通PCR，但不建議用來(lái)測(cè)序。整理課件模板上沒(méi)有引物結(jié)合位點(diǎn)●現(xiàn)象：沒(méi)有特異性的測(cè)序峰圖●原因：引物無(wú)法結(jié)合模板●對(duì)策重新設(shè)計(jì)引物整理課件引物二聚體●現(xiàn)象：前面100多bp噪音高，后面正常〔引物二聚體片段小大在100bp左右〕●原因：引物二聚體未去除干凈●對(duì)策：割膠純化整理課件雙引物結(jié)合●現(xiàn)象：從一開(kāi)始〔區(qū)別于非單克隆〕就出現(xiàn)兩套峰●原因：模板有兩個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)和兩個(gè)引物結(jié)合●對(duì)策：重新設(shè)計(jì)單個(gè)引物整理課件二、模板對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響①模板不純②點(diǎn)突變〔SNP〕③移碼突變④雜合子⑤非單克隆整理課件噪音信號(hào)高終止峰PCR正常終止后面的噪音峰PCR正常終止正常模板與噪音整理課件模板不純〔非特異性PCR產(chǎn)物〕●現(xiàn)象：每個(gè)峰下面都有其它顏色●原因：PCR主帶與雜帶混在一起測(cè)序●對(duì)策：凝膠電泳回收主帶，重新測(cè)序割膠純化整理課件點(diǎn)突變〔SNP〕突變點(diǎn)如果模板有單核苷酸〔堿基〕突變〔SNP〕，測(cè)序圖形中其他的位點(diǎn)一般都是單一的峰形，然后突然在某一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)重疊峰(如圖中箭頭所示)。整理課件移碼突變?cè)?50bp處因點(diǎn)突變導(dǎo)致移碼，在528bp處又因點(diǎn)突變恢復(fù)整理課件雜合子雜合變點(diǎn)雜合信號(hào)處的套峰強(qiáng)度大小相等，都相當(dāng)于正常峰值的一半。整理課件非單克隆特征：左邊清晰，右邊全部像雜合子

原因：挑克隆時(shí)兩個(gè)質(zhì)?；煸谝黄饘?duì)策：新挑克隆，重新制DNA整理課件三、純化對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響①染料峰②酒精峰③熒光物質(zhì)污染④釘子峰⑤有機(jī)物污染〔瀑布效應(yīng)〕整理課件染料峰特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是剩余的A、T、C、G、4個(gè)BigDye峰，其不影響其它序列的可靠性。整理課件酒精峰特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp堿基之間，圖譜被“透明〞抬高，其同樣不影響其它序列的可靠性。整理課件熒光物質(zhì)污染●現(xiàn)象：紅色峰異常高?！裨颍何粗蠓肿訜晒馕镔|(zhì)污染，恰好是紅色，被軟件誤認(rèn)為紅色峰?！駥?duì)策：依次更換水、緩沖液、甲酰胺、測(cè)序膠、毛細(xì)管；清洗或更換膠引導(dǎo)塊、針筒。整理課件“釘子〞峰●現(xiàn)象：四色并存突然拔起的尖峰，峰形銳利?！裨颍好?xì)管內(nèi)有氣泡、灰塵、尿素結(jié)晶等，對(duì)激光全反射。●對(duì)策–灌膠時(shí)，防止氣泡產(chǎn)生；–上樣前，樣品先離心；–毛細(xì)管、檢測(cè)窗口保持清潔；–膠內(nèi)有尿素結(jié)晶時(shí)，注意不要吸進(jìn)注射器；–樣品純化干凈。整理課件有機(jī)物污染〔瀑布效應(yīng)〕●現(xiàn)象：基線從高處突然下降?！裨颍河袡C(jī)物進(jìn)入毛細(xì)管，受激發(fā)產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，抬高基線?！駥?duì)策：依次更換水、緩沖液、甲酰胺、測(cè)序膠、毛細(xì)管；清洗或更換膠引導(dǎo)塊、針筒。整理課件四、困難模板對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響①特殊結(jié)構(gòu)②Ploy結(jié)構(gòu)③高GC④重復(fù)序列⑤回文結(jié)構(gòu)整理課件特殊結(jié)構(gòu)整理課件Poly結(jié)構(gòu)Poly在序列的前端對(duì)信號(hào)影響較小,Poly在序列的后端對(duì)信號(hào)影響較大。Poly-G/poly-C很容易導(dǎo)致信號(hào)中斷和信號(hào)亂。整理課件高GCPoly-G/poly-C是高GC的一種，很容易導(dǎo)致信號(hào)衰減。局部高GC一般會(huì)導(dǎo)致信號(hào)中斷和亂峰。整理課件重復(fù)序列GT重復(fù)導(dǎo)致信號(hào)衰減A/G重復(fù)導(dǎo)致信號(hào)衰減或信號(hào)亂整理