環(huán)境生物技術(shù)課件

第八章污染物生物毒性和致突變性的微生物學(xué)監(jiān)測方法第一節(jié)污染物生物毒性的微生物監(jiān)測方法第二節(jié)污染物致突變性的微生物監(jiān)測方法生物測試（Bioassay）的概念：指系統(tǒng)地利用生物的反應(yīng)測定一種或多種污染物或環(huán)境因素單獨(dú)或聯(lián)合存在時所導(dǎo)致的影響或危害。注釋1：所利用的生物反應(yīng)包括分子、細(xì)胞、組織、器官、個體、種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)各級水平上的反應(yīng)。注釋2：生物測試不同于常規(guī)的物理、化學(xué)檢測。前者能夠測定污染物對生物機(jī)體的影響，而后者只能測定污染物的濃度。例如：通過水污染的生物測試可獲得以下數(shù)據(jù)：各種環(huán)境因素如DO、pH、溫度、混濁度等對生命的有利以及不利的濃度或強(qiáng)度；污染物對受測生物的毒性；各種水生生物對污染物的相對敏感性；廢水所應(yīng)處理的程度；允許的污染物排放濃度等。毒性試驗常用參數(shù)致死劑量或致死濃度（LethalDose，LethalConcentration）絕對致死劑量或致死濃度（LD100、LC100）半數(shù)致死劑量或濃度（LD50、LC50）最小致死劑量或濃度（MLD、MLC）最大耐受劑量或濃度（LD0、LC0）最大無作用劑量（MaximumNo－effectLevel）每日容許攝入量（AcceptableDailyIntake）最高容許濃度（MaximumAllowableConcentration）毒作用帶急性毒作用帶（Acute－toxicEffectZone）慢性毒作用帶（Chronic－toxicEffectZone）半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）和半數(shù)抑制濃度（IC50）:影響或抑制微生物正常生理指標(biāo)值50%所需的待測物濃度。檢測毒性的手段：動物檢測、微生物檢測動物檢測急性毒性：研究化學(xué)物質(zhì)大劑量一次染毒或24小時內(nèi)多次染毒動物所引起的毒性的試驗。其目的是短期內(nèi)了解該物質(zhì)的毒性大小和特點(diǎn)，并為進(jìn)一步開展其他毒性試驗提供設(shè)計依據(jù)。急性毒性試驗類型哺乳動物急性毒性試驗水生生物急性毒性試驗蚯蚓急性毒性試驗觀察時間為2周，以半數(shù)致死濃度LC50表示。微生物檢測選擇一項或幾項生理指標(biāo)為指征，根據(jù)代謝物影響或抑制這些指征的程度來判斷毒性的強(qiáng)度。評價指標(biāo)多為EC50或IC50（二）試驗方法菌種復(fù)蘇：2%NaCl，懸液樣品處理：系列稀釋，調(diào)pH6-8，滲透壓2%NaCl毒性測定：測試管加入樣品和菌液，以苯酚作陽性有機(jī)毒物對照，以ZnSO4.7H2O作陽性無機(jī)毒物對照，蒸餾水為陰性對照。15oC培養(yǎng)5min或15min。光量抑制百分率：（陰性對照組指標(biāo)值-實驗組指標(biāo)值）陰性對照組指標(biāo)值通過回歸方程計算IR為50%時的樣品劑量，IC50質(zhì)量控制：同一劑量平行管間的發(fā)光強(qiáng)度差異值小于20%，苯酚和硫酸鋅的IC50有一定范圍。x100%IR=（三）方法評價與傳統(tǒng)魚類96h毒性試驗相比具有良好的一致性。1991年Diane對100種化學(xué)物質(zhì)的毒性測試結(jié)果表明兩者的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.85。可以根據(jù)細(xì)菌生物發(fā)光試驗的發(fā)光抑制率進(jìn)行毒性分級。各實驗室間結(jié)果的重現(xiàn)性好可用于生物傳感器分析國際標(biāo)準(zhǔn)化組織將該方法作為檢測化合物或廢水毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法之一（ISO9509）。（一）試驗原理毒性污染物抑制硝化作用的酶類，導(dǎo)致對底物的利用能力或產(chǎn)物的生成量下降。通過測定底物或產(chǎn)物的變化來檢測毒性作用的程度。利用亞硝化單胞菌或硝化桿菌屬，或用活性污泥。二、硝化細(xì)菌—硝化作用抑制試驗（二）試驗方法（以硝化桿菌屬為例）增殖細(xì)菌至108個/ml。加入菌液、NaNO2溶液及樣品（不同濃度），以蒸餾水為對照。培養(yǎng)（30oC4h)、檢測NO2-比較樣品組與對照組硝化作用強(qiáng)度，可得IC50與Microtox靈敏度相當(dāng)，與魚類毒性試驗結(jié)果的相關(guān)性為0.45。美國國家環(huán)保局認(rèn)可的毒性測試方法。（一）實驗原理藻類對水體污染反應(yīng)十分敏感。毒物抑制光合作用，藻類生長量減少。常用硅藻、柵藻、小球藻。（二）試驗方法繁殖藻種配制培養(yǎng)基，滅菌。加入待測物，接種。培養(yǎng)。恒溫（28-30°C），光照。測定生長量（或其他指標(biāo)），繪制生長曲線。計算最大生長率。（μmax）（三）結(jié)果與評價三、藻類—生長抑制試驗又稱為微型生物群落監(jiān)測法，廣泛用于水環(huán)境的毒性監(jiān)測與評價。微生物包括細(xì)菌、真菌、原生動物、藻類及小型輪蟲。國家標(biāo)準(zhǔn)：水質(zhì)微型生物群落監(jiān)測PFU法(

(GB/T12990-91)

（一）試驗原理正常條件下自然水環(huán)境的微型生物群落種類、分布、構(gòu)成有一定規(guī)律，外界環(huán)境因素的干擾下，群落的平衡被破壞，結(jié)構(gòu)特征也隨之變化。通過分析微型群落結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)，判斷水環(huán)境的質(zhì)量狀況或污染物質(zhì)的毒性特征。檢測結(jié)果有很強(qiáng)的生態(tài)學(xué)意義。PFU法是在群落水平上的,是較物種水平、種群水平更高的,因此它能提供較大的環(huán)境真實性。四、原生動物—微尺度群落級毒性試驗最常用的方法是PFU（聚氨酯泡沫塑料塊）法。聚氨酯泡沫塑料塊的孔徑100-150um，微型生物可以進(jìn)入其內(nèi)，能收集到85%的種類，具有環(huán)境真實性。一定時間內(nèi)，原生動物種群構(gòu)成會達(dá)到平衡，而有害物會破壞這一平衡，比較試驗組和對照組的群落結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)，即可評價水體質(zhì)量與污染程度。（二）試驗方法與評價把PFU分別浸入對照水體和調(diào)查水體，不同時段后，擠出液體，對原生動物鑒定和計數(shù)。PFU中微型生物的結(jié)構(gòu)與功能參數(shù)：異養(yǎng)性指數(shù)（HI）=微型生物灰份量/葉綠素a量原生動物群落多樣性指數(shù)（d）=（S-1）/lnN(S為原生動物種類數(shù)，N為10ml擠出液中原生動物個數(shù)）T90：達(dá)到90%Seq所需的時間（Seq：平衡時原生動物種數(shù)）G:原生動物群集速度常數(shù)評價：污染程度高，S、d降低嚴(yán)重污染的水域中，原生動物的群集速度亦很低，隨著水質(zhì)的清潔程度提高，原生動物的群集速度亦迅速提高。溢流口24小時內(nèi)僅群集了3種耐污鞭毛蟲。而通惠河沿岸的站點(diǎn)，如24小時內(nèi)，雙橋站點(diǎn)群集了19種，東關(guān)站點(diǎn)群集了33種，對照站點(diǎn)溫榆河群集了37種。

檢測待測物的毒性（種類損傷法）：清潔水體中浸泡的PFU擠出液（接近平衡期的、未成熟的群落。未成熟群落要比成熟群落對污染的毒性反應(yīng)敏感得多）混合不同濃度的待測物，培養(yǎng)一定時間后鏡檢原生動物種數(shù)，計算待測物影響原生動物種數(shù)的EC50（medianeffectconcentration，半數(shù)效應(yīng)濃度）（一）脫氫酶活性試驗原理：脫氫酶作用下，無色的氯化三苯基四氮唑（TTC）受氫后變?yōu)榧t色的三苯甲基（TF），分光光度計485nm處比色，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求的TF產(chǎn)生量，計算脫氫酶活性?？梢缘贸龃郎y物的EC50.五、活性污泥毒性檢測法（二）呼吸抑制試驗有毒物抑制微生物呼吸作用，使耗氧量和CO2的產(chǎn)生量下降。檢測化合物和廢水毒性。瓦勃氏呼吸儀測定消耗的氧量：堿溶液吸收CO2，反應(yīng)瓶中壓力的降低完全是氧消耗的結(jié)果。溶解氧電極測定耗氧量：瓶塞上的溶解氧電極記錄溶解氧；相對耗氧速率=污泥的呼吸好氧速率/內(nèi)源性呼吸好氧速率x100%優(yōu)點(diǎn)：簡便靈敏快速經(jīng)濟(jì)缺點(diǎn)：檢測結(jié)果有一定范圍的變異性；不能完全代替哺乳動物毒性試驗。適用：快速篩選大批量樣品用細(xì)菌生物發(fā)光抑制試驗，廢水處理影響效果用活性污泥毒性檢測法，評價水質(zhì)的生態(tài)學(xué)特征用微尺度群落級毒性試驗。微生物學(xué)檢測方法的評價一、基因突變試驗（一）鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體試驗（Ames試驗）1、原理野生型his+營養(yǎng)缺陷性his+

致突變物可使該菌的基因發(fā)生回復(fù)突變。美國Ames教授1975年正式建立的方法第二節(jié)污染物致突變性的微生物檢測方法正向突變回復(fù)突變試驗菌株：曾推薦的5株：TA1535、TA1537、TA1538、TA98、TA10083年修訂之后：TA97、TA98、TA100、TA102賦予其他附加突變：uvrB突變：失去DNA切割修復(fù)能力，敏感性增加；rfa突變：脂多糖屏障卻失，大分子透入；組入某些質(zhì)粒提高回變能力。后來一套6株組氨酸缺陷型菌株：TA7001、TA7002、TA7003、TA7004、TA7005、TA7006.方便檢出堿基的變異。每次試驗可使用一種或幾種菌株，只要有任何一株發(fā)生大量的回復(fù)突變，即為陽性結(jié)果。哺乳動物微粒體酶：微粒體中含有混合功能的氧化酶系；有降解作用：把化學(xué)物變成低毒或無毒物排出；有激活作用：使化學(xué)物變成具有親電子性質(zhì)，導(dǎo)致毒性增強(qiáng)，成為致突變物或致癌物。哺乳動物微粒體酶系統(tǒng)（簡稱S9混合液）：從肝勻漿中制取；加入S9混合液使體外測試條件更接近于人體內(nèi)代謝條件。2、試驗方法紙片點(diǎn)試法：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+菌液+S9+表層培養(yǎng)基紙片蘸取待測物至于培養(yǎng)皿中間培養(yǎng)37oC,48h,觀察結(jié)果。長出密集菌落的為陽性，只長出少量散在菌落的為陰性。平皿摻入法：最高的誘發(fā)回變菌落數(shù)為自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍或以上屬陽性結(jié)果。3、應(yīng)用與評價175種已知致癌物進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)157種為陽性，陽性吻合率90%；陰性吻合率87%。初篩報警手段。已被我國食品安全毒理學(xué)評價程序、農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗方法、新藥毒理學(xué)研究指導(dǎo)原則、化妝品安全性評價程序和方法等列為評價致突變性的必做試驗。1、原理致突變物使發(fā)光細(xì)菌暗變異菌株突變，恢復(fù)一定的發(fā)光能力。菌株：蝠魚發(fā)光桿菌的暗變異菌株SD-18和RC93、費(fèi)氏弧菌的暗變異株P(guān)f-13、明亮發(fā)光桿菌T3小種的暗變異株T9171。2、方法細(xì)菌復(fù)蘇、增殖、分裝測試管培養(yǎng)（20°C、）、24h后開始測發(fā)光強(qiáng)度，以后每隔3-4天測定一次。發(fā)光強(qiáng)度為對照管發(fā)光強(qiáng)度的3倍或以上即為陽性。（二）發(fā)光細(xì)菌試驗（一）SOS顯色試驗SOS修復(fù)是指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生存率，但留下的錯誤較多，故又稱為錯誤傾向修復(fù)（error-pronerepair），使細(xì)胞有較高的突變率。致突變物→DNA損傷→細(xì)菌SOS修復(fù)→測定SOS修復(fù)能力→（通過大腸桿菌PQ37菌株的顯色反應(yīng)）二、DNA損傷修復(fù)試驗PQ37菌株的特點(diǎn)：操縱子融合方法構(gòu)建的，將SOS反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的sfiA基因與編碼β-半乳糖苷酶的基因lacZ融合在一起（報告基因），β-半乳糖苷酶通過Xgal培養(yǎng)基和β–ONPG培養(yǎng)基來顯色，分別產(chǎn)生藍(lán)色和黃色。定性試驗：Xgal培養(yǎng)基平板，紙片點(diǎn)試,出現(xiàn)藍(lán)色色素即為陽性。定量試驗：液體培養(yǎng)基（含待測樣品）,37°C,2h,加入β–ONPG顯色一定程度，終止反應(yīng)，420nm處測吸光度。R大于2且具有劑量關(guān)系，則為陽性結(jié)果。應(yīng)用評價：敏感性與準(zhǔn)確性與Ames試驗相當(dāng)，某些方面優(yōu)于后者，可以相互補(bǔ)充。（二）聚合酶缺陷型菌株試驗致癌物使DNA受損，聚合酶缺陷型菌株在DNA受損后無修復(fù)能力，不能生存，抑菌圈出現(xiàn)。E.coliP3478(polA-),對照為野生型菌株E.coliW3110(polA+)。點(diǎn)試法、混菌法，分別出現(xiàn)抑菌圈和有空白的生長線（抑菌現(xiàn)象）。對直接突變作用的烷化劑較為敏感，對需要代謝活化的化合物不敏感。（三）重組缺陷型菌株試驗重組缺陷型菌株失去修復(fù)能力，致癌性物質(zhì)使DNA受損，重組缺陷型菌株不能生長，原理與聚合酶缺陷型菌株試驗相似。枯草芽孢桿菌H17(recA+）對照，全線生長枯草芽孢桿菌M45(recA-）試驗，抑菌現(xiàn)象（四）溶源性細(xì)菌試驗原理：原噬菌體誘變劑烈性噬菌體（噬菌體誘導(dǎo)現(xiàn)象）

→裂解非溶源性細(xì)菌（作為指示菌）→固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)噬菌斑菌株：E.colik12(λ)——溶源性E.colik12(S)—