基因工程-2-載體課件

質(zhì)粒載體載體噬菌體載體

動物病毒載體大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322

單鏈DNAM13載體

SV40載體

乳頭瘤病毒載體昆蟲桿狀病毒載體柯斯(COS)載體

λ噬菌體載體

枯草桿菌質(zhì)粒載體pNC3

酵母菌質(zhì)粒載體2μ

農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體Ti一基因工程的基本元件

------載體四、E.coli質(zhì)粒載體

1.pBR322

是基因工程中最重要的一個人工質(zhì)粒,有萬能質(zhì)粒之美稱.①pBR322的構(gòu)建復制子:松弛型選擇標記:Amp、Tet篩選形式:抗性插入失活單一切點:24個③物理圖譜②pBR322的特性pBR322plasmidF.BolivarR.L.RodriguezBacterialResistancepBR322酶切圖譜2.pUC系統(tǒng)美國加利福尼亞大學的科學家J.Messing和J.Vieria于1987年首先構(gòu)建來自pBR322質(zhì)粒的復制起點氨芐青霉素的抗性基因大腸桿菌β-半乳糖酶基因的啟動子及其編碼的α-肽鏈基因（lacZ’）位于lacZ’基因內(nèi)的一段MCS區(qū)段酵母菌質(zhì)粒載體食品級微生物適合于真核基因表達基因產(chǎn)物外分泌七、酵母菌質(zhì)粒載體

多數(shù)酵母中含有一種能獨立復制的環(huán)狀雙鏈DNA，稱為2μ質(zhì)粒，長約6.3kb，有單一的復制起始點和一個自主復制功能區(qū)域（ARS片段）。整合型、復制型、附加型和穩(wěn)定型等類型。

①含有E.coli質(zhì)粒的復制起始序列。②含有酵母的篩選標記（如LEU2）③具有合適的供外源基因插入的限制酶切割位點。2.酵母菌質(zhì)粒載體的特點1.酵母菌質(zhì)粒載體的類型TypeNameDescriptionbacterialoriginColE1ColE1(pUC-type)originofreplicationpromoterGal1-10promoterGal1-10yeastpromoterselectablemarkerampRampicillinresistancegeneselectablemarkerchlRchloramphenicolresistancegeneLOSTinrecombined(withinsert)formselectablemarkerURA3URA3auxotrophyselectablemarker(yeast)yeastcentromereCEN4yeastcentromericsequenceyeastoriginARS1ARS1yeastoriginofreplication④酵母菌穩(wěn)定型質(zhì)粒載體

著絲粒第二節(jié)噬菌體載體一、λ噬菌體載體

1.λ噬菌體結(jié)構(gòu)特點:

①線性雙鏈DNA分子②可在E.coli中大量繁殖③具非必需區(qū)(約1/3長度）④兩端具12個核苷酸單鏈互補粘性末端

λ噬菌體線性DNA分子的粘性末端及其環(huán)化作用（a）具有互補單鏈末端（粘性末端）的λDNA分子。（b）當進入宿主細胞后，通過粘性末端之間的堿基配對作用實現(xiàn)的線性分子的環(huán)化作用，由此形成的雙鏈區(qū)叫做cos位點GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACGcos5’-P5’-P3’3’粘性末端環(huán)化作用（a）（b）2、λ噬菌體的缺陷與改造λ噬菌體的缺陷：⑴酶切點太多5個BamH1位點，6個BglⅠ位點，5個EcoRⅠ位點。⑵野生型只能接納一定長度的DNA。λ噬菌體的75-105%，只能接納49kb×5%=2.45kb的DNA。λ噬菌體的改造：⑴切去非必須區(qū)段，在切去的同時，加載目的基因（15-23Kb）；⑵去除過多的酶切位點，每種酶只留1-2個切口；⑶增加選擇標記基因（selectablemarker）；⑷

建立λDNA的體外包裝。主要外殼蛋白質(zhì)是基因E的產(chǎn)物頭部前體連環(huán)DNA基因A的產(chǎn)物在cos位點切割噬菌體DNA包含在外殼中的基因D的產(chǎn)物基因W和FII的產(chǎn)物組裝蛋白質(zhì)加完整的尾部噬菌體的包裝過程sup-細菌頭部基因

（琥珀突變型）尾部基因

（琥珀突變型）轉(zhuǎn)錄復制

蛋白質(zhì)合成組裝尾部所需要的組分“無頭部”的提取物組裝頭部所需要的組分“無尾部”的提取物溫育完整的噬菌體轉(zhuǎn)錄復制

蛋白質(zhì)合成T4噬菌體的體外包裝λDNA的體外包裝體外包裝的重組DNA比裸露的DNA導入受體細胞的效率高100-10000倍4.凱倫噬菌體載體克隆過程5.λ噬菌體載體優(yōu)點:用途:主要用于建立真核生物的基因文庫

①感染高效:比質(zhì)粒高百倍

②容量大:可達15Kb

(不得超過原來長度的105%,不得短于原來長度的75%)

③易操作,易保藏二、柯斯(COS)載體(cosmid)

1.柯斯載體的組成

帶有抗藥性標記帶有質(zhì)粒的復制起始點帶有多個限制酶的單一切點帶有λ噬菌體粘性末端片段

由質(zhì)粒和λ粘性末端“尾巴”兩部分組成。2.柯斯載體的特點

3.cosmid載體的優(yōu)點

能象λDNA一樣體外包裝，并高效導入受體細胞可以裝載比質(zhì)粒或λDNA大得多的外源DNA片段cos區(qū)1.7kb+質(zhì)粒部分3.3kb46.5Kb外源DNA由于攜帶質(zhì)粒的選擇標記，便于篩選由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點，便于克隆。利用柯斯載體載體進行基因克隆的一般程序三、M13噬菌體克隆載體

1.M13的特性:環(huán)狀,單鏈DNA,6.407Kb

2.M13噬菌體作為載體優(yōu)越性單鏈DNA噬菌體的復制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復制形式的DNA簡稱RFDNA；不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌；單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的大小制約的，不存在包裝限制問題；可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。2.M13載體的構(gòu)建

五、噬菌體展示載體其基本原理是將外源DNA片段插入噬菌體編碼蛋白基因PⅢ中，使外源DNA片段對應的表達產(chǎn)物融合在噬菌體的外殼蛋白中形成融合蛋白，呈現(xiàn)在噬菌體表面。質(zhì)粒λ噬菌體柯斯質(zhì)粒單鏈噬菌體克隆DNA大片段±*++-構(gòu)建基因組文庫-++-構(gòu)建DNA文庫+