攻毒第10周實驗進(jìn)課件

攻毒第10周實驗進(jìn)展匯報實驗1《禽白血病病毒斑點雜交方法的建立與初步應(yīng)用》的修改。該文已被中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報接收。實驗2禽白血病A亞群（RAV-1)病毒攻毒實驗第7-10周抗凝血淋巴細(xì)胞的分離和淋巴細(xì)胞RNA的提取。淋巴細(xì)胞RNA的反轉(zhuǎn)錄。1-10周淋巴細(xì)胞RNA和CDNA樣品-80度保存。1-10周血清樣品和紅細(xì)胞的-80度保存。實驗3：死亡雞(0918）的RT-PCR檢測0918（G88雞群）雞于攻毒后第55天死亡，該雞出現(xiàn)羽毛粗亂，精神萎靡，發(fā)育不良，腹部增大，腹部羽毛沾污等臨床癥狀。剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟輕微腫大，脾臟萎縮，肌胃和腺胃嚴(yán)重腫大，胃黏膜脫落，肌胃和腺胃交接處乳頭消失，胃壁變薄，十二指腸出血等病變。取病死雞的心、肝、脾、腎、法氏囊和胸腺，常規(guī)處理后提取基因組DNA和總RNA。PCR檢測結(jié)果1：心基因組；2:肝基因組；3：脾基因組；4：腎基因組；5：胸腺基因組；6：法氏囊基因組；7：心CDNA；8：肝CDNA；9：脾CDNA；10：腎CDNA；11:胸腺CDNA；12：法氏囊CDNA123456789101112陽水0961死亡雞的PCR檢測編號為0961（G5雞群）的雞于攻毒后第65天死亡，該雞出現(xiàn)厭食、消瘦、虛弱、雞冠發(fā)皺、貧血等臨床癥狀。剖檢病變?yōu)楦闻K嚴(yán)重充血并腫大，腺胃腫大，胃壁變薄，十二指腸和胰腺有散在出血點。取該雞的心、肝、脾、腎、胸腺、法氏囊提取基因組和總RNA，并進(jìn)行PCR檢測。0919死亡雞的PCR檢測編號為0919雞（G88雞群）與攻毒后第69天死亡，該雞出現(xiàn)發(fā)育不良、精神沉郁、嘔吐、羽毛豎立、貧血等臨床癥狀。剖檢病變?yōu)楦闻K嚴(yán)重充血，肝表面出現(xiàn)血管瘤，心胞出血，脾臟輕微腫大，腎臟腫大并出血，肺臟和胰腺均出現(xiàn)嚴(yán)重的充血現(xiàn)象。取該雞的心、肝、脾、腎、胸腺、法氏囊提取基因組和總RNA，并進(jìn)行PCR檢測。0919死亡雞PCR檢測結(jié)果

123456789101112陽水1：心基因組；2:肝基因組；3：脾基因組；4：腎基因組；5：胸腺基因組；6：法氏囊基因組；7：心CDNA；8：肝CDNA；9：脾CDNA；10：腎CDNA；11:胸腺CDNA；12：法氏囊CDNA0968死亡雞的PCR檢測結(jié)果編號為0968(G5雞群)的雞攻毒后第72天死亡，該雞出現(xiàn)身體消瘦，精神沉郁，嘔吐，羽毛粗亂，雞冠泛白等臨床癥狀。剖檢病變?yōu)楦闻K嚴(yán)重充血，肝小葉尖端出現(xiàn)深黃色區(qū)域，十二指腸嚴(yán)重充血并發(fā)黑，腎臟腫大。取該雞的心、肝、脾、腎、胸腺、法氏囊提取基因組和總RNA，并進(jìn)行PCR檢測。0968死亡雞PCR檢測

123456789101112陽水1：肝基因組；2:心基因組；3：脾基因組；4：腎基因組；5：胸腺基因組；6：法氏囊基因組；7：肝CDNA；8：心CDNA；9：脾CDNA；10：腎CDNA；11:胸腺CDNA；12：法氏囊CDNA死亡雞各組織中RAV-1的PCR統(tǒng)計表雞群編號天數(shù)心肝脾腎胸腺法氏囊心CDNA肝CDNA脾CDNA腎CDNA胸腺CDNA法氏囊CDNAG2092518------++----G5097132-+-----+++-+G88091855-+---+++++-+G88091969++-+-+++++-+G5096165-+---+++++++G5096872++-+--++++++G88099540------------小結(jié)從上述PCR統(tǒng)計表可以看出，試驗在RAV-1攻擊后的第18天即可檢測出病毒，直到攻毒后第72天。在對組織中病毒的檢測發(fā)現(xiàn)，肝臟是病毒檢出率最高的器官，其次是心臟和法氏囊，然后是腎臟，而在脾臟和胸腺中的檢出率很低。實驗5：RAV-1攻毒實驗第1-9周各雞群體重的統(tǒng)計學(xué)分析實驗6:RAV-1攻毒實驗第1-9周各雞群抗體的消長變化二重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件的優(yōu)化及該檢測方法的建立小結(jié)經(jīng)過對退火溫度及各反應(yīng)組分濃度的優(yōu)化，最后確定二重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系如下：最佳反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3min，變性95℃15s，退火61.3℃50s。40個PCR循環(huán)。最佳反應(yīng)體系：反應(yīng)體系為25ul，其中10×ExBuffer2.5ul，dNTP（2.5nmol/ul）2μL、HsExTaq酶0.5μL、上下游引物（10pmol/ul)各1μL、探針（10pmol/ul)各1μL,重組質(zhì)粒模板各1μL，雙蒸水加至25μL.RAV-1攻毒后第1-4周淋巴細(xì)胞CDNA樣品的熒光定量PCR檢測RAV-1攻毒后第1-10周各雞群死亡率的統(tǒng)計表雞群個體總數(shù)死亡個體數(shù)死亡率%