1-2發(fā)?酵?工?程?的?無?菌技術(shù) 教學課件-高二生物蘇教版選擇性必修三

第一章

發(fā)酵工程第2節(jié)發(fā)酵工程的無菌技術(shù)生物（蘇教版）高中生物選擇性必修31.概述平板劃線法分離和純化微生物的過程。2.概述稀釋涂布平板法分離和純化微生物的過程。3.進行土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)。學習目標1.科學思維：能通過平板劃線法和稀釋涂布平板法的操

作，掌握微生物分離和純化的基本方法。2.科學探究：學會配制選擇培養(yǎng)基，以分離出能分解尿

素的細菌，并對實驗結(jié)果進行分析和評價。素養(yǎng)要求一、平板劃線法分離和純化微生物平板劃線法:

通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面，從而獲得單個菌落的方法。菌落：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面

或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定

形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，這就是菌落。單菌落：一般由一個細胞繁殖而來的肉眼可見

的純種菌落,即單菌落。微生物群分散或稀釋單個細胞單個菌落繁殖通過平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落倒平板的具體操作1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。2.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。

防止空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。4.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。1、將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。2、在火焰旁冷卻接種環(huán)，并拔出裝有酵母菌的棉塞3、將試管口通過火焰.4、將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，蘸取一環(huán)菌液5、將試管通過火焰，并塞上棉塞6、左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基7、灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連8、將平板倒置放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。劃3個平板（重復(fù)實驗）1個不劃線（空白對照）1）一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；2）存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。平板劃線法的具體操作第1區(qū)劃線接種環(huán)滅菌第2區(qū)劃線接種環(huán)滅菌第3區(qū)劃線接種環(huán)滅菌接種環(huán)滅菌分區(qū)劃線法12345①接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次.②劃線首尾不能相接③每次劃線前接種環(huán)進行滅菌④劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)平板劃線法注意事項:素養(yǎng)提升(1)平板劃線法的原理是什么？提示：平板劃線法的原理是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到單個菌落。(2)灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？提示：避免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。(3)在做第二次劃線以及其后的操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？提示：劃線末端含有的細菌數(shù)目較少，每次從上一次劃線的末端開始劃線能夠使細菌的數(shù)目隨劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終分散成單個的細菌。平板劃線操作中三種灼燒的目的不同項目目的挑取菌體前灼燒避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染菌種每次劃線前灼燒殺死上一次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時接種環(huán)上的菌種直接來源于上一次劃線的末端劃線操作結(jié)束后灼燒及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免菌種污染環(huán)境和感染操作者(4)為何最后一次劃線不能與第一次劃線相連？提示：最后一次劃線已經(jīng)將細菌稀釋成單個的細胞，如果與第一次劃線相連則增加了細菌的數(shù)目，得不到純化的效果。(5)平板劃線法接種菌種時，哪些操作可防止雜菌污染？提示：①接種前將接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒。②劃完一個區(qū)域后，將接種環(huán)灼燒，冷卻后再劃下一區(qū)域。③接種環(huán)蘸取菌液時，要將試管口、棉塞等通過火焰。④劃線時將培養(yǎng)皿的皿蓋打開一條縫隙，將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃線后及時蓋上皿蓋。(6)接種操作完成后，需將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時倒置的目的是什么？提示防止水分過快揮發(fā)，防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。(7)若在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，原因是什么？提示原因可能是菌種不純，混入其他雜菌，或在實驗操作過程中被雜菌污染。將未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2天，若無菌落生長，說明培養(yǎng)基的配制成功；否則制備失敗，需重新配制。(8)如何檢查培養(yǎng)基制備是否合格？典題應(yīng)用1.下列關(guān)于倒平板的敘述，錯誤的是A.待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時倒平板B.倒平板整個過程應(yīng)在酒精燈火焰旁進行C.完全打開培養(yǎng)皿皿蓋，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，左手立

即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋D.為避免水滴滴入培養(yǎng)基，平板應(yīng)倒過來放置及時反饋知識落實√2.(2021·江蘇蘇州月考)微生物接種的方法很多，平板劃線法是常用的一種。如圖是平板劃線示意圖，劃線的順序為①②③④。下列相關(guān)敘述錯誤的是A.劃線操作時，將挑有菌體的接種環(huán)插入培養(yǎng)基B.平板劃線后培養(yǎng)微生物時要倒置培養(yǎng)C.不能將第④次的劃線與第①次的劃線相連D.在第②～④次劃線前都要對接種環(huán)進行滅菌√二、稀釋涂布平板法分離和純化微生物1.稀釋涂布平板法：將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，使其中的微生物充分分散，培養(yǎng)后在平板培養(yǎng)基表面形成多個單菌落。應(yīng)用：既可用于菌種的分離和純化，也可以用于微生物的計數(shù)。①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。1mL1ⅹ1090mL無菌水1ⅹ1071ⅹ1051ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1041mL1mL1mL1mL9mL無菌水1mL②取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌稀釋涂布平板法的操作過程③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，培養(yǎng)核心歸納1.分離尿素分解菌操作中的注意事項(1)在實驗操作中，每個步驟都要注意無菌操作，以防培養(yǎng)基被污染，影響實驗效果。(2)樣品稀釋液的最佳濃度為培養(yǎng)后每個平板上有30～300個菌落的濃度。(3)每一稀釋倍數(shù)的菌液都至少要涂布3個平板，作為重復(fù)實驗，求其平均值，若其中有菌落數(shù)與其他平板差別很大的，則需要重新實驗。2.試比較兩種分離和純化方法項目操作特點結(jié)果稀釋涂布平板法取一定稀釋度的樣品涂布平板↓用無菌玻璃涂布器將樣品涂布均勻先制作平板后加入菌液細菌菌落通常僅在平板表面生長混合平板法取稀釋的少量菌懸液與50℃左右的培養(yǎng)基混合均勻↓將與樣品混合后的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中菌液與培養(yǎng)基混合，共同倒平板細菌菌落出現(xiàn)在平板表面和內(nèi)部核心探討甲、乙兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。1.甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230，該同學的統(tǒng)計結(jié)果

(填“可靠”或“不可靠”)，若不可靠，應(yīng)如何改進？突破重難強化素養(yǎng)提示為增加實驗的說服力與準確性，應(yīng)設(shè)置重復(fù)實驗，在同一稀釋度下至少涂布3個平板，統(tǒng)計結(jié)果后計算平均值。不可靠2.乙同學在該濃度下涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學將21舍去，然后取平均值。該同學對實驗結(jié)果的處理

(填“合理”或“不合理”)。微生物計數(shù)時，如果實驗中出現(xiàn)重復(fù)實驗的結(jié)果差別很大的情況，應(yīng)

，找出差異的原因，而不能簡單地將結(jié)果舍棄后進行計數(shù)。不合理分析實驗過程中可能的影響因素3.某同學在三種稀釋度下吸取0.1mL的菌液涂布平板，統(tǒng)計菌落數(shù)，得到以下的數(shù)據(jù)，試計算1g樣品的活菌數(shù)。平板菌落數(shù)稀釋度平板1平板2平板3104320360356105212234287106212318提示105的稀釋度下取0.1mL的菌液涂布的三個平板上的菌落數(shù)在30～300之間，計算其平均值為(212＋234＋287)/3≈244。進一步可以換算出1g樣品中活菌數(shù)為244×105÷0.1＝2.44×108(個)。4.為什么統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低？提示當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。典題應(yīng)用3.用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，其中正確的是A.涂布了1個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230B.涂布了2個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是215和260，取平均值238C.涂布了3個