第八章 細胞凋亡

概述細胞凋亡過程與機制細胞凋亡與疾病細胞凋亡的檢測

第八章細胞凋亡編輯課件悉尼·布雷諾爾羅伯特·霍維茨約翰·蘇爾斯頓2002年諾貝爾生理與醫(yī)學獎獲得者概述編輯課件

一、細胞死亡的模式■Necrosis=細胞病理性死亡■Apoptosis=細胞自發(fā)性死亡壞死凋亡編輯課件apoptosis編輯課件Conceptofapoptosis:體內(nèi)外生理或病理因素觸發(fā)細胞內(nèi)死亡程序→細胞死亡編輯課件細胞壞死與細胞凋亡的區(qū)別編輯課件細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別特征細胞凋亡細胞壞死誘導因素生理及弱刺激強烈刺激受累范圍單個細胞喪失成群細胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失細胞體積減小、固縮增大腫脹染色質(zhì)凝聚成半月形稀疏成網(wǎng)狀細胞器無明顯變化腫張破壞溶酶體保持完整破壞外溢細胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機降解大分子合成一般需要不需要基因調(diào)控有無后果不引起炎癥反響引起炎癥反響意義生理死亡方式病理死亡方式編輯課件凋亡的生理學意義:■胚胎發(fā)育期去除某些細胞■維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定增殖細胞群中細胞去除、去除潛在有害的自身反響性淋巴細胞■參與防御反響細胞毒T細胞凋亡過多或缺乏→→疾?。耗[瘤、艾滋病、神經(jīng)變性性疾病、缺血性損傷編輯課件

二、凋亡時細胞的主要變化1.形態(tài)學改變〔Themorphologiccharacteristicsofapoptosis〕

凋亡細胞〔實體細胞〕與周圍細胞脫接觸胞膜空泡化〔Blebbing〕細胞固縮〔Condensation〕、核固縮和發(fā)芽凋亡小體〔Apoptoticsmallbody〕編輯課件細胞凋亡編輯課件(掃描電鏡)正常細胞(掃描電鏡)(透射電鏡)

凋亡細胞—凋亡小體編輯課件DNA片斷化caspase激活滅活凋亡抑制物水解活性蛋白水解結(jié)構(gòu)蛋白Ca2+/Mg2+

Zn2+核酸內(nèi)切酶激活①②③2.生化改變〔Thebiochemicalcharacteristicsofapoptosis〕鈣超載編輯課件■DNA片段化〔DNAladdingpattern〕核酸內(nèi)切酶激活

核小體連接區(qū)DNA降解180～200bp整數(shù)倍的DNA片段編輯課件

■細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻編輯課件凋亡的過程及機制凋亡誘導因素死亡信號凋亡相關(guān)基因激活

Caspases激活、DNase激活凋亡的執(zhí)行

巨噬細胞吞噬分解凋亡細胞凋亡細胞清除

編輯課件凋亡的機制編輯課件細胞凋亡的兩條通路：死亡受體途徑、線粒體途徑編輯課件〔1〕死亡受體途徑

〔deathreceptorpathway〕死亡受體〔deathreceptor,DR〕腫瘤壞死因子受體超家族成員，跨膜蛋白，與相應(yīng)配體結(jié)合傳遞細胞信號

Fas(CD95),TNFR1,RAIL-R2/DR5編輯課件參與死亡受體信號轉(zhuǎn)導的接頭蛋白：死亡結(jié)構(gòu)域蛋白〔deathdomainprotein,DD〕TRADD：TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白TNF+TNFR1〔死亡結(jié)構(gòu)域〕+TRADD→→細胞凋亡FADD：Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白FasL+Fas〔死亡結(jié)構(gòu)域〕+FADD→→細胞凋亡

編輯課件FasL+Fas凋亡誘導復合物〔DISC〕

FADD〔C端DD結(jié)構(gòu)域與Fas胞內(nèi)段結(jié)合N端DED結(jié)構(gòu)域與無活性caspase8酶原交聯(lián)〕caspase8酶原聚集到復合物上一系列caspase激活細胞凋亡

編輯課件FADD〔Fas-associateddeathdomain〕DD〔deathdomain〕DED〔deatheffectordomain〕FSALFADDPro-caspase-8Caspase-8Caspase-3Pro-caspase-3細胞凋亡FasDEDDEDDD編輯課件編輯課件〔2〕線粒體途徑線粒體釋放細胞色素C→→細胞凋亡

PT孔開放→線粒體跨膜電位↓，細胞色素C釋放促凋亡蛋白Bax促PT孔開放抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl抑制PT孔開放編輯課件細胞色素C+Apaf-1+caspase9前體—凋亡體

召集并激活caspase3→→細胞凋亡Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子編輯課件膜通透性↑、線粒體腫脹、△

m↓Apaf-1活化Cyt.c線粒體途徑〔mitochondrialpathway〕Ca2+NO缺氧活性氧應(yīng)激PT開放Cyt.c+Pro-caspase-9Caspase-9ATPApaf-1+Apaf-1活化Cyt.cCARDApoptosomeAIFcaspase-independentapoptosisPro-Caspase-3凋亡Caspase-3BidCaspase-8編輯課件Caspase依賴的細胞凋亡

〔Caspase-dependentapoptosis〕Caspase特點：--以酶原的形式存在--酶活性依賴于半胱氨酸殘基的親核性--水解天冬氨酸C端肽鍵故稱Caspases(Cysteine，asparticacid，protease)

編輯課件Caspase家族的分類凋亡啟動亞類Caspase蛋白酶：Caspase8，Caspase9，Caspase10凋亡效應(yīng)亞類Caspase蛋白酶：Caspase3，Caspase6，Caspase7ICE(interlukin-1βconvertingenzyme)亞類Caspase蛋白酶：參與炎癥反響Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11,Caspase12，Caspase13，Caspase14編輯課件■Caspase通路分類

啟動亞類〔Caspase-8,-9,-10〕效應(yīng)亞類〔Caspase-3,-6,-7〕▲

Caspase死亡受體途徑線粒體途徑大小亞基結(jié)合（二聚體）caspase激活（四聚體）■

Caspase激活形式Pro-caspase：NH2末端結(jié)構(gòu)域、20KD亞基、10KD亞基剪切編輯課件編輯課件Caspase可激活CAD(caspase-activatedDNase)核酸酶，該酶在核小體的連接區(qū)將DNA切斷，形成約200bp整倍數(shù)的核酸片段正常情況下，CAD與抑制物ICAD-DFF-45結(jié)合，存在于胞質(zhì)中，無活性Caspase活化后降解抑制物ICAD，CAD激活并入核降解DNA使其片段化編輯課件Pro-caspase-2caspase-2Pro-caspase-6Caspase-6Pro-caspase-7caspase-7Pro-caspase-9ICAD（抑制性CAD）CAD（caspase活化DNA酶）CDA進入細胞核內(nèi)降解DNA細胞凋亡剪切細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白caspase-9EffectorcaspaseCaspase-3Pro-caspase-3編輯課件Caspase的作用編輯課件Caspase非依賴的細胞凋亡〔Caspase-independentapoptosis〕■凋亡誘導因子〔AIF〕線粒體蛋白AIF釋放到胞質(zhì)內(nèi)與抑制凋亡的因子結(jié)合，從而促發(fā)凋亡

■鈣超載編輯課件鈣超載引起凋亡機制胞漿[Ca2+]↑■激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄■激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，降解DNA鏈■激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，使細胞骨架分解→凋亡小體細胞凋亡編輯課件細胞凋亡的調(diào)控凋亡相關(guān)因素凋亡信號的轉(zhuǎn)導凋亡相關(guān)基因編輯課件（Themainlyinducedfactorsofapoptosis）

Table：Influencefactorsofapoptosis

誘導性因素（Inducers）抑制性因素（Inhibitors）理化因素射線、高溫、強酸、細胞因子IL-2、NGF等強堿、應(yīng)激、抗癌藥激素ACTH、睪丸酮、雌激素激素和因子糖皮質(zhì)激素、TNF其它Zn2+、苯巴比妥、半胱氨免疫性因素CTL分泌的粒酶酸蛋白酶抑制劑、EBV、病原體因素HIV、HCV牛痘、病毒、中性氨基酸

1、影響細胞凋亡的因素編輯課件2、凋亡信號轉(zhuǎn)導的特點①多樣性：不同種類細胞有不同的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)②偶聯(lián)性：死亡信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)與細胞增殖、分化過程中的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在一些環(huán)節(jié)上交叉、偶聯(lián)③同一性：不同凋亡誘導因素可通過同一信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)引起細胞凋亡④多途性：同一凋亡誘導因素可經(jīng)過多條信號途徑觸發(fā)細胞凋亡編輯課件3、細胞凋亡的調(diào)控基因

〔Regulatedmechanismofapoptosis〕表1細胞凋亡的調(diào)控基因

功能基因抑制凋亡基因Bcl-2Bcl-XL、A1/Bfl-1、Bcl-w、Bcl-G和Mcl-1等促凋亡基因P53、Bax、Bad、Bak、Bid、Bim、Bik、Bok、Bcl-B、Bcl-Xs、Krk、Mtd、Nip3、Nix、Noxa等雙向調(diào)控基因c-myc、Belx編輯課件Bcl-2基因〔Bcelllymphoma/leukemia-2〕廣泛存在于造血細胞、上皮細胞、淋巴細胞、神經(jīng)細胞及多種瘤細胞Bcl-2家族已發(fā)現(xiàn)15個成員，可分為3個亞族：Bcl-2亞家族：抑制細胞凋亡Bax亞家族：促進細胞凋亡BH3亞家族：促進細胞凋亡編輯課件編輯課件Bcl-2抑制凋亡機制：■

抑制線粒體PT孔開放，Cyt.c、AIF釋放↓■結(jié)合和滅活Apaf-1，阻斷caspase-9活化■特異性結(jié)合細胞色素C■維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)編輯課件c-myc,bcl-x促進增殖c-myc(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)誘導凋亡Bcl-XL→抑制凋亡Bcl-xBcl-Xs→促進凋亡GF編輯課件p53促凋亡機制：--與Bcl-2基因相互作用，下調(diào)Bcl-2的表達--誘導線粒體內(nèi)凋亡的相關(guān)蛋白〔Bax等〕表達，并觸發(fā)細胞色素C釋放和caspase活化--誘導死亡受體Fas表達

編輯課件C-myc雙向調(diào)控凋亡調(diào)控細胞周期基因，編碼的蛋白是DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。GF充足時主要激活介導細胞增殖的基因GF缺乏時激活凋亡基因編輯課件

凋亡與疾病〔Diseasesassociatedtoapoptosis〕

表：與細胞凋亡異常相關(guān)的疾病

凋亡不足凋亡過度腫瘤肝癌、惡性血液腫瘤、乳腺癌發(fā)育異常氣管-食管瘺、房（室）間隙缺、膀胱癌、肺癌、膠質(zhì)瘤、前損、唇（腭）裂、短肢畸形、列腺癌等尿道下裂以及多囊腎等發(fā)育異常先天性消化道、膽道、肛門狹CNSAlzheimer病、Parkinson病、窄或閉鎖、動脈導管未閉、兩肌萎縮性側(cè)索硬化癥、色素性性畸形、甲狀舌骨囊腫等視網(wǎng)膜病，脊肌肉萎縮、早老免疫系統(tǒng)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、類性癡呆風濕性關(guān)節(jié)炎、橋本甲狀腺炎免疫系統(tǒng)免疫缺陷病、AIDS、多發(fā)性的硬化癥等編輯課件〔一〕細胞凋亡缺乏〔Apoptosisinhibition〕1.腫瘤〔Tumor〕■bcl-2基因過表達85%濾泡狀和20%彌漫性B細胞淋巴瘤染色體t〔14;18〕易位IgH基因與bcl-2基因拼接bcl-2基因活化細胞凋亡速率↓腫瘤發(fā)生〔乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等也存在Bcl-2高表達〕編輯課件■p53基因缺失或突變p53的穩(wěn)定性、細胞內(nèi)定位或〔和〕活性異常p53表達或功能缺陷細胞凋亡率↓腫瘤發(fā)生

■病毒的癌基因HBV編碼的HBX是Caspase-3的強效抑制物，與肝癌發(fā)生密切相關(guān)編輯課件■異常融合蛋白慢性髓細胞性白血病〔CML〕染色體易位t(9；22)Bcr-abl融合基因〔p210Bcr-abl蛋白質(zhì)〕NF-B活化、細胞凋亡速率↓髓系祖細胞的克隆擴增腫瘤發(fā)生編輯課件2．自身免疫病〔Autoimmunediseases〕針對自身抗原的免疫細胞未被及時去除，機體產(chǎn)生針對自身抗原的體液免疫和細胞免疫，導致器官組織損傷。編輯課件〔二〕細胞凋亡過度〔Apoptosisexcess〕1.心肌缺血與缺血-再灌注損傷■特點▲缺血早期以凋亡為主，晚期以細胞壞死為主?！诠Ｋ涝畹闹行囊詨乃罏橹鳎Ｋ涝钪苓呉缘蛲鰹橹?；▲輕度缺血以凋亡為主，重度缺血以壞死為主；■機制▲氧化應(yīng)激▲Fas通路▲p53基因轉(zhuǎn)錄增加編輯課件細胞凋亡在疾病防治中的意義㈠合理利用凋亡相關(guān)因素1.誘導靶細胞凋亡

放療、化療

高熱、高溫2.減少細胞凋亡：NGF、促生長因子、抗氧化劑抑制Bcl-2抗凋亡作用促進促凋亡基因作用增強P53促凋亡作用編輯課件㈡干預凋亡信號轉(zhuǎn)導㈢調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因㈣控制凋亡相關(guān)酶學機制㈤防止線粒體跨膜電位的下降編輯課件細胞凋亡的檢測1、細胞凋亡的形態(tài)學及流式細胞術(shù)檢測2、磷脂酰絲氨酸外翻分析〔AnnexinV法〕3、線粒體膜勢能〔mt〕的檢測4、DNA片斷化檢測5、TUNEL法6、Caspase-3活性的檢測7、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的表達和細胞定位分析

編輯課件1、細胞凋亡的形態(tài)學檢測

光學顯微鏡和倒置顯微鏡

未染色細胞：凋亡細胞V變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期可見凋亡小體。染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。

電子顯微鏡觀察編輯課件NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess〔488nm400〕編輯課件電鏡觀察凋亡細胞體積變小，胞質(zhì)