色素提取試驗(yàn)方法

一、暗紫貝母內(nèi)生真菌紅色素的提取及穩(wěn)定性研究張輝東，曾雪麗，陳鵲，吳衛(wèi)（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川雅安625014）1．2方法1.2.1紅色素的生產(chǎn)和提取工藝菌種一擴(kuò)培一發(fā)酵一收集菌體一超聲波提取一減壓濃縮一紅色素粗品。1.2.2菌體培養(yǎng)從保存試管培養(yǎng)基斜面上挑取單菌落接種于PDA培養(yǎng)基中，28°C，恒溫培養(yǎng)3d,將菌絲轉(zhuǎn)接于裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中（150mL/250mL）,總計(jì)20瓶，放于26C、110r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)7d,抽濾，棄上清液，得紅色菌體。1.2.3不同溶劑下紅色素的提取方法稱(chēng)濕菌體6份，每份2.0g,分別加入去離子水、甲醇、乙醇、甲醇和丙酮的混合液（1：1,V:V，下同）、丙酮、乙酸乙酯40mL，在超聲功率400W、超聲10S間歇20S條件下超聲破碎30min,過(guò)濾除去菌體，即為紅色素在不同溶劑中的提取液。紅色素的吸收光譜稱(chēng)取濕菌體2.0g，20mL丙酮作溶劑，超聲波法提取紅色素，抽濾得紅色素溶液，在25C下用日本島津UV2450型紫外分光光度計(jì)于190nm到500nm范圍內(nèi)掃描測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，紅色素在210nm處有一個(gè)最大吸收峰，該峰為紅色素2.2不同溶劑對(duì)紅色素提取量的影響根據(jù)1.2.3所述方法獲得的不同溶劑的紅色素提取液，分別在210nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度（OD）值。紅色素在210nm處的OD值與紅色素含量呈正比，OD值越大，單位體積中紅色素的含量越高，即溶解度越大，提取量越高。結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn)，紅色素在不同溶劑中測(cè)得的OD值不同即溶解度不同。在室溫條件下，紅色素在丙酮中的OD值最大，溶解度最大，提取量最大。2．3紅色素的穩(wěn)定性分析2．3．1酸堿度對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響取紅色素提取液12等分，以NaOH和HCI溶液調(diào)pH,在室溫下用pH酸度計(jì)調(diào)節(jié)各溶液的pH分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,室溫（25°C）下避光放置0.5h后，在210nm下測(cè)定OD值，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，當(dāng)pHV7時(shí)，隨著pH降低，紅色素溶液OD值減少，顏色呈淺黃色，pH三7時(shí)，紅色素溶液OD值變化不大，顏色呈紅色，說(shuō)明紅色素在堿性環(huán)境中較穩(wěn)定。2.3.2溫度對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響取pH為9的紅色素溶液，分別在25、40、60、80、100C恒溫水浴中放置0.0、0.5、1.0、1.5h,冷卻至室溫后定容至相同體積，在210nm處測(cè)定OD值，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，pH為9時(shí)，紅色素溶液在25C到100C范圍內(nèi)，隨溫度的升高，其OD值有先增大后減小的趨勢(shì)，但顏色變化不明顯，可能是紅色素中某化合物的吸光基團(tuán)因溫度的升高構(gòu)象有所改變導(dǎo)致的。說(shuō)明該化合物的熱穩(wěn)定性較好。2.3.3光照對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響將pH為9的紅色素溶液分別置于光照和黑暗環(huán)境下，間隔一定時(shí)間測(cè)定各溶液OD值，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4和試驗(yàn)觀察可知，光照條件下，紅色素溶液的OD值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸變小，從第3天開(kāi)始，顏色逐漸變淡，直至第6天，近于無(wú)色，而放于黑暗條件下的溶液，OD值基本保持不變，而且顏色也無(wú)明顯變化，說(shuō)明紅色素對(duì)光照不穩(wěn)定?？赡苁枪庹蘸蜏囟鹊耐瑫r(shí)作用，使得紅色素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，減少了其溶液的OD值。2.3.4紫外光對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響在波長(zhǎng)210nm的紫外燈下照射pH為9的紅色素溶液，分別在照射了0、20、40、60、80、100min時(shí)測(cè)定OD值，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，在紫外光的照射下，紅色素溶液在210nm處的OD值只在一個(gè)較小的范圍內(nèi)波動(dòng)，說(shuō)明紫外光對(duì)紅色素的吸光基團(tuán)影響不大，對(duì)紅色素的穩(wěn)定性影響不大。2.3.5碳水化合物添加劑對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響取紅色素溶液，分別配制含蔗糖、葡萄糖濃度為30g/L的紅色素溶液，在室溫（25C）下避光放置0.5h后，在210nm下測(cè)定OD值，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，不加任何碳水化合物添加劑的紅色素溶液（對(duì)照）的最大OD值為1.486，而加了碳水化合物添加劑的紅色素溶液在放置4d后，OD值及溶液顏色變化不大，沒(méi)有沉淀產(chǎn)生，說(shuō)明葡萄糖和蔗糖對(duì)紅色素的穩(wěn)定性沒(méi)有影響。2.3.6氧化劑H2O2對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響取紅色素溶液，配制H2O2濃度為0.00%、0.03%、0.30%、50%、3.00%（V/V,下同）的紅色素溶液，在室溫（25°C）下避光放置0.5h后，在210nm處測(cè)定OD值，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，未添加H2O2的紅色素溶液的OD值比含有H2O2的紅色素溶液的OD值大很多，且隨著H2O2濃度的增大，最大OD值逐漸減小，顏色明顯變淺。說(shuō)明該紅色素耐氧化性較差，易因氧化而退色，應(yīng)用時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)氧化劑的加入。3.7還原劑Na2SO3對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響取紅色素溶液，配制Na2SO3濃度為0、2X10—4、5X10—4、1X10—3、3X10—3、5X10—3mol/L的紅色素溶液，在室溫（25C）下避光放置0、1、2、3、4d后，在210nm處測(cè)定OD值，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，該紅色素隨還原劑Na2SO3濃度的增大，放置時(shí)間的增長(zhǎng)，顏色變淺，在前3dOD值減小，第4天又稍有增大，說(shuō)明該色素的耐還原性較差，第4天由于Na2SO3被空氣氧化，還原性減弱，紅色素溶液的OD值又有所增大。2.3.8金屬離子對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響取紅色素溶液，配制含不同金屬離子Na+、K+、Mg2+、Co2+、AI3+、Pb2+、Sn2+，濃度均為1X10—4mol/L的紅色素溶液，在室溫（25C）下避光放置不同的時(shí)間0、24h后，在210nm處測(cè)定OD值，結(jié)果見(jiàn)表9。從表9可知，24h后含Co2