超聲波提取黑豆異黃酮

響應(yīng)面優(yōu)化超聲波法提取黑豆異黃酮的工藝研究1．材料與方法1.1材料與儀器材料：將產(chǎn)自吉林、河北、陜北、江西、山東等地黑豆洗凈在60?65°C烘干粉碎過(guò)篩分為20、40、60、80、100、120目備用，金雀異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（洛陽(yáng)市創(chuàng)偉化玻有限公司），95%乙醇（天津市永大化學(xué)試劑公司）設(shè)備：722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司），BS-124S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）,101-1AB型干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），SK5210HP型超聲波清洗器（上海康華生化儀器制造廠），KDF-2311型多功能食品粉碎機(jī)（天津市達(dá)康電器有限公司），標(biāo)準(zhǔn)分析篩（浙江上虞市華豐五金儀器有限公司）1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1黑豆異黃酮工藝流程圖黑豆粉末-乙醇浸泡-超聲波提取-過(guò)濾-測(cè)定異黃酮含量1.2.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取金雀異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品5.00mg,用95%乙醇溶解,定容至50mL容量瓶中。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL的溶液于10mL容量瓶中，再分別加入5.0mL95%乙醇，然后用蒸餾水定容。在波長(zhǎng)259nm下測(cè)定吸光度。以金雀異黃酮濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=1606.9966X-0.013（R2=0.9980）1.2.3異黃酮提取率的計(jì)算黑豆異黃酮提取液在波長(zhǎng)259nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得異黃酮的濃度［3］。黑豆異黃酮提取率（％）=黑豆中異黃酮的含量/黑豆的重量X100%1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別以乙醇濃度、粒度、液料比、提取時(shí)間、溫度、提取次數(shù)為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討其對(duì)黑豆異黃酮提取率的影響。稱取8份粒度為80目的黑豆粉5.0000g,按液料比20:1（mL/g）分別加入濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h,然后在50C下超聲處理20min。稱取顆粒粒度為20、40、60、80、100、120目黑豆粉各5.0000g，按液料比20:1（mL/g）加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h,然后在50C下超聲處理20min。稱取9份100目黑豆粉5.0000g，按液料比10:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h,然后在50C下超聲處理20min。稱取7份100目黑豆粉5.0000g,按液料比45:1加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h,在溫度20C、30C、40C、50C、60C、70C、超聲處理20min。稱取6份100目黑豆粉5.0000g,按液料比45:1加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h,在50C超聲處理10min、20min、30min、40min、50min、60min。稱取100目黑豆粉5.0000g,按液料比45:1加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h,在50C超聲處理50min,冷卻，過(guò)濾，再同樣條件下分別超聲處理1、2、3、4、5次。

1.2.5響應(yīng)面分析在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇液料比、提取時(shí)間、溫度進(jìn)行三因素三水平的中心組合實(shí)驗(yàn)，利用Design-expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定超聲波法提取黑豆異黃酮的最佳工藝參數(shù)。2.結(jié)果與分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析乙醇濃度(%)乙醇濃度對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響乙醇濃度(%))%(率取提圖1乙醇濃度對(duì)黑豆異黃酮提取率的影響Fig.1Effectofethanolconcentrationsonyieldofisoflavonefromblacksoybean由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加，黑豆異黃酮的提取率隨之增加。在乙醇濃度高于60%以后曲線平緩，提取率的增加相對(duì)較小。因?yàn)辄S酮類化合物易溶于乙醇，乙醇濃度高有利于顆粒中物質(zhì)滲透溶解，而乙醇濃度過(guò)大時(shí)，蛋白質(zhì)，糖類等易溶于水的大分子會(huì)在乙醇溶液中發(fā)生凝聚，使提取液變稠，影響了黃酮的快速擴(kuò)散溶出，提取率的增加減少。從經(jīng)濟(jì)方面考慮，選擇60%為最適乙醇濃度。顆粒粒度對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響

1.2粒度(目)圖2顆粒粒度對(duì)黑豆異黃酮提取率的影響由圖2可以看出，隨著粒度增加，黑豆異黃酮提取率也隨之增加，粒度為100目時(shí)，異黃酮提取率最大；粒度大于100目時(shí)，隨著粒度的增加異黃酮提取率下降。這說(shuō)明，在一定粒度范圍內(nèi)，隨粒度的增加黃酮的溶解性增強(qiáng)，但粒度過(guò)細(xì)，會(huì)使黃酮在樣品顆粒表面的吸附增加，從而降低其在溶劑中的溶解性。因而選擇100目為最適粒度。液料比對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響液料比(mL/g)圖3液料比對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響由圖3可知，隨著液料比的增加，黑豆異黃酮提取率也隨著增加，液料比為45:1時(shí)，異黃酮的提取率達(dá)到最大值；之后隨著液料比的增大，異黃酮提取率隨之下降，原因是液料比過(guò)大使溶劑的量過(guò)多時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)的過(guò)多溶出，從而影響異黃酮溶解。因而最適液料比選擇為45:1。提取溫度對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響

溫度（°C）圖4溫度對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響由圖4可以看出，隨著提取溫度的升高，黑豆異黃酮提取率也隨之升高。溫度為50C時(shí)異黃酮提取率最大，溫度大于50C時(shí)，提取率反而下降?？赡苁怯捎诟邷貢?huì)破壞異黃酮的結(jié)構(gòu)，影響異黃酮的提取效果。因此選擇50C為最適提取溫度。提取時(shí)間對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響時(shí)間（min）圖5時(shí)間對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響由圖5可見(jiàn)，隨著提取時(shí)間的增加，黑豆異黃酮的提取率會(huì)隨之增加。增加提取時(shí)間會(huì)使物質(zhì)能更加充分的溶解，使顆粒中物質(zhì)溶解完全，但在50min后提取率的增加相對(duì)較小,只會(huì)增加提取的成本，從經(jīng)濟(jì)以及操作方面考慮。因此選擇50min為最適提取時(shí)間。提取次數(shù)對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響

2.0提取次數(shù)（次）圖6提取次數(shù)對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響由圖6可以看出，隨著提取次數(shù)的增加異黃酮的提取率也增加。提取次數(shù)會(huì)使顆粒中物質(zhì)溶解更為完全，提取更為充分，但在提取2次以后，異黃酮提取率的增加相對(duì)較小，從經(jīng)濟(jì)與操作方面考慮。因此選擇2次為最適提取次數(shù)。2.2響應(yīng)面結(jié)果與分析2.2.1回歸模型的建立與分析根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取影響黑豆異黃酮提取率的主要因素（液料比、時(shí)間、溫度）進(jìn)行三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)，利用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化的黑豆異黃酮提取工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。表1三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表水平X］液料比/g/mLX2提取溫度/°cX3提取時(shí)間/min-140:14040045:15050150:16060表2-因素-水平中心組合實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果實(shí)驗(yàn)口號(hào)XiX2X3提取率（％）110-11.38221011.40330111.66140001.90050-1-11.431601-11.601

70-111.59280001.87591001.456100001.842111001.32112-1001.59813-1-1-11.57814-1001.41815-1111.570160001.883170001.891根據(jù)表2數(shù)據(jù)，利用軟件DesignExpert進(jìn)行液料比、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素對(duì)黑豆異黃酮提取率影響的回歸分析，建立三元二次響應(yīng)面回歸方程：Y=1.88-075X+0.069X+0.030X-0.011XX+7.250E-003XX-0.026XX-0.026X2-0.17X123121323122-0.14X2(R2=0.9841R2。=0.9636)3 Adj。表3回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表

方差來(lái)源自由度平方和均方F值P值顯著性回歸模型90.0630.07048.00<0.0001**X110.0450.04531.160.00008**X210.0380.03826.200.0014*X310.0069620.0069624.790.0648X1X210.00050630.00050630.350.05737X1X310.00021020.00021020.140.7150X2X310.0026520.0026521.820.2189X1210.0280.028194.60<0.0001**X2210.120.1284.41<0.0001**X3210.0780.07853.350.0002**殘差70.0100.001454失擬項(xiàng)30.0081950.0027325.51凈誤差40.0019830.0004957總和160.64注：**-(p<0.01)為極顯著；*-(p<0.05)為顯著。從表3可知，回歸方程極顯著，預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值具有高度的相關(guān)性(R50.9841)。擬合程度>90%，說(shuō)明模型能夠反映響應(yīng)值的變化，說(shuō)明這種實(shí)驗(yàn)方法可靠，使用該方程模擬真實(shí)的三因素三水平的分析可行。失擬項(xiàng)差異不顯著，說(shuō)明殘差均由隨機(jī)誤差引起；由表3中可知，液料比、提取溫度的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)黑豆異黃酮的提取率的影響極顯著或顯著提取時(shí)間的二次項(xiàng)對(duì)對(duì)黑豆異黃酮的提取率的影響顯著，而一次項(xiàng)不顯著。表明實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是一種非線性關(guān)系。因此，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)超聲波法提取黑豆異黃酮的工藝條件。而各因素的交互作用對(duì)黑豆異黃酮提取率的影響不顯著2.2.2黑豆異黃酮提取工藝響應(yīng)面分析與優(yōu)化響應(yīng)曲面反映了當(dāng)液料比、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素的任意兩個(gè)變量取零點(diǎn)水平的時(shí)候，其它兩個(gè)因素的交互作用對(duì)黑豆異黃酮提取率的影響情況。曲面陡表明該因素對(duì)提取率的影響顯著，曲面平緩表明該因素對(duì)提取率的影響不顯著；等高線的形狀反映兩因素交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表明交互作用強(qiáng)，影響顯著，圓形則相反；等高線密集表明對(duì)提取率影響較大，稀疏表明影響較小。2.2.2.1液料比與提取溫度的交互作用§§圖7液料比與提取溫度的交互作用對(duì)提取率的影響從圖7可看出，液料比的曲面較陡，溫度的曲面較平緩，說(shuō)明液料比對(duì)異黃酮提取率的影響顯著，提取溫度的影響不顯著；圖7中等高線沿液料比軸向較溫度軸向密集，說(shuō)明液料比對(duì)異黃酮提取率的影響比溫度大；等高線為圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用較弱，對(duì)黃酮提取率的影響不顯著。2.2.2.2液料比與提取時(shí)間的交互作用圖8液料比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)提取率的影響從圖8可看出，液料比的曲面較陡，提取時(shí)間的曲面較平緩，說(shuō)明液料比對(duì)異黃酮提取率的影響顯著，提取時(shí)間的影響不顯著；圖8中等高線沿液料比軸向較時(shí)間軸向密集，說(shuō)明液料比對(duì)異黃酮提取率的影響比時(shí)間大；等高線為圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用較弱，對(duì)異黃酮提取率的影響不顯著。2.2.2.3提取溫度與提取時(shí)間的交互作用60.0(]C：時(shí)間1.78751.4555-00B:溫度1.6751.56255000500060.0055.0060.0(]C：時(shí)間1.78751.4555-00B:溫度1.6751.56255000500060.0055.0040.0040.0045.0045.00圖9提取溫度與提取時(shí)間的交互作用對(duì)提取率的影響從圖9中可看出，提取溫度和提取時(shí)間的曲面都比較平緩，說(shuō)明這兩個(gè)因素對(duì)異黃酮提取率的影響均不顯著；圖9中等高線沿溫度軸向較時(shí)間軸向密集，說(shuō)明溫度對(duì)異黃酮提取率影響比時(shí)間大；等高線為圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用較弱，對(duì)黃酮提取率的影響不顯著2.3黑豆異黃酮最佳提取條件的確定和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)綜上所述，在選取的各因素范圍內(nèi)，影響黑豆異黃酮提取效果的因素由強(qiáng)到弱依次為液料比、溫度、提取時(shí)間。根據(jù)回歸模型通過(guò)Design-Expert軟件分析得出，以60%乙醇為提取劑、顆粒粒度100目、連續(xù)提取2次條件下，超聲波法提取黑豆異黃酮的最佳條件為液料比45.74:l(mL/g)、提取時(shí)間50.86min、溫度為52.01°C，黑豆異黃酮提取率的預(yù)測(cè)值為1.891%?？紤]到實(shí)際情況，確定最佳提取工藝條件為：液料比46:1(mL/g)、溫度52C、提取時(shí)間51min。在此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際平均值為1.883%，與預(yù)測(cè)值偏差較小,說(shuō)明該回歸方程與實(shí)際情況擬合較好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說(shuō)明響應(yīng)面法適用于對(duì)超聲波法提取黑豆異黃酮的工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。2.4不同產(chǎn)地的黑豆異黃酮的測(cè)定超聲波提取法：準(zhǔn)確稱取粒度為100目的樣品一定量，按液料比46:1加入60%乙醇，室溫浸泡2h，52C超聲處理51min,連續(xù)處理2次。由表4可以看出，在最佳提取條件下對(duì)不同產(chǎn)地的黑豆異黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示產(chǎn)地為吉林的黑豆異黃酮含量最高。表4不同產(chǎn)地黑豆異黃酮的測(cè)定吉林 山東 河北 陜北 江西超聲波法1.883% 1.659% 1.584% 1.702% 1.358%3結(jié)論以產(chǎn)于吉林的黑豆為材料，采用超聲波法對(duì)黑豆異黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用DesignExpert軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法對(duì)黑豆