DB34-T 4268-2022 發(fā)酵茶中B族和G族黃曲霉毒素的測定

ICS

67.140CCS

X

5534 DB34/T

4268—2022發(fā)酵茶中

B

族和

G

族黃曲霉毒素的測定Determination

of

B

G

groups

in

發(fā)布

實施安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)

布DB34/T

4268—2022 本文件按照GB/T

1.1—2020《標準化工作導則

第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。本文件由安徽農業(yè)大學提出。本文件由安徽省農業(yè)農村廳歸口。物研究所。本文件主要起草人：周育、管道健、張海柱、唐蜀昆、張梁、王希春。DB34/T

4268—2022

族和

1 范圍2本文件規(guī)定了發(fā)酵茶中黃曲霉毒素B1B2G1G（以下簡稱1、2AFB2、AFG1和AFG2）的測定方法。本文件第一法為雙柱凈化-1、2、AFG1和AFG2含量的測定。本文件第二法為雙柱凈化-液相色譜柱串聯質譜法，適用于發(fā)酵茶中AFB1、2、AFG1和2含量的測定。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB

5009.22食品安全國家標準

食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定3 術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4 第一法

雙柱凈化-高效液相色譜柱后光化學衍生法原理試樣中的1、2、AFG1、AFG2-水溶液或甲醇-器檢測。外標法定量。試劑及材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為

GB/T

6682

規(guī)定的一級水。4.2.1 試劑4.2.1.1

甲醇（CH3，：）：色譜純。4.2.1.2

乙腈（CH3，：）：色譜純。4.2.1.3

氯化鈉（NaCl，CAS：7647-14-5）。4.2.1.4

磷酸氫二鈉（Na2HPO4，：7558-79-44.2.1.5

磷酸二氫鉀（KH2PO4，CAS：7778-77-04.2.1.6

氯化鉀（，：7447-40-74.2.1.7

鹽酸（HCl，CAS：）。DB34/T

4268—20224.2.1.8

吐溫（C58H114O，：9005-64-5）。4.2.1.9

硫酸鎂（MgSO4，CAS：7487-88-9）。4.2.1.10

聚乙烯基吡絡烷酮（PVP，CAS：9003-39-8）。4.2.1.11

N-丙基乙二胺（PSA，CAS：111-39-7）。4.2.2 材料4.2.2.1

移液管：1

mL

和

5

mL

規(guī)格。4.2.2.2

針筒式濾器：

規(guī)格，可連接于空氣壓力泵或手動加壓。4.2.2.3

玻璃纖維濾紙：快速、高載量、液體中顆粒保留

μm。4.2.2.4

真菌毒素多功能凈化柱（以下簡稱多功能凈化柱）。4.2.2.5

免疫親和柱：1

柱容量

≥200

ng，AFB1柱回收率≥80%，AFG2的交叉反應率≥80%。4.2.2.6一次性針式過濾器：帶

μm

有機相微孔濾膜。4.2.3 試劑配制4.2.3.1 乙腈-水溶液（84+16）：取

840

mL

乙腈加入

160

mL

水，混勻。4.2.3.2 甲醇-水溶液（70+30）：取

700

mL

甲醇加入

300

mL

水，混勻。4.2.3.3 磷酸鹽緩沖溶液（以下簡稱

PBS）：稱取

8.00

g

氯化鈉、1.20

g

磷酸氫二鈉、0.20

g

磷酸二氫鉀、0.20

g

900

mL

至

7.4

1000

mL。4.2.3.4 含

1%

吐溫-20

的

10

mL

吐溫

定容至

1000

mL。4.2.4 標準品4.2.4.1 AFB1C17H12O6，CAS：1162-65-8≥標準物質。4.2.4.2 AFB2C17H14O6，CAS：7220-81-7≥標準物質。4.2.4.3AFG1C17H12O7，CAS：1165-39-5≥標準物質。4.2.4.4AFG2C17H14O7，CAS：7241-98-7≥標準物質。4.2.5 標準溶液配制4.2.5.1標準儲備溶液分別稱取1、2、AFG1

和AFG2

各1

mg（精確至

mg

液濃度為

μg/mL，溶液轉移至試劑瓶中后，在

℃

下避光保存、備用，有效期三個月。臨用前，參照

進行濃度校準。4.2.5.2混合標準工作液（1和

1

100

μg/L，2和

AFG2

25

μg

移液管準確移取AFB1和1標準儲備溶液各

1

mL，2和2標準儲備溶液各

μL

至

容量瓶中，乙腈定容。密封后避光

℃

下保存，一個月內有效。4.2.5.3 標準系列工作溶液稀釋DB34/T

4268—2022要求。儀器和設備4.3.1

高速粉碎機。4.3.2

渦旋振蕩器或搖床。4.3.3

天平：感量

0.01

g

和

g。4.3.4

渦旋混合器。4.3.5

離心機：轉速

≥6000

×g。4.3.6

固相萃取裝置：配

mL

免疫親和層析針筒。4.3.7

空氣壓力泵。4.3.8

氮吹儀。4.3.9

液相色譜儀：配熒光檢測器。4.3.10

液相色譜柱。4.3.11

黃曲霉毒素光化學柱后衍生器。4.3.12

篩網:

1

mm～2

mm

試驗篩孔徑。分析步驟4.4.1 取樣4.4.1.1 茶湯采樣量需大于

1

L，將所有液體樣品在一個容器中混勻后，取其中任意的

mL

用。4.4.1.2 干茶采樣量需大于

2

法縮分至

g，儲存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。4.4.2 提取4.4.2.1 茶湯取

50

mL

試樣（精確至

0.01

），然后加入

50

乙腈（精確至

0.01

），

g

氯化鈉（精確至

0.01g），渦旋

1

min，6000

×g

10

min，取上清液，再加入

50

mL

乙腈重復提取，然后合并兩次上清液，并加入

2

g

氯化鈉（精確至

0.01

g），2

g

硫酸鎂（精確至

0.01

g），5

gPVP（精確至0.01

g），2

g

PSA（精確至0.01

g6000

×g

10

min，上清液用玻璃纖維濾紙過濾，收取慮液備用。4.4.2.2 干茶稱取

5

g

試樣（精確至

0.01g

50

離心管中，加入

25

mL

乙腈-水溶液（）或甲醇-水溶液（4.2.3.2），渦旋混勻，置于渦旋振蕩器或搖床中振蕩

20

min，將茶葉及取提液全部轉移至針筒式濾器，真空抽濾（或手動加壓過濾）。收集全部提取液于離心管中，在

6000

×g

下離心

min，上清液用玻璃纖維濾紙過濾，收取慮液備用。4.4.3 凈化DB34/T

4268—20224.4.3.1 多功能凈化柱凈化移取適量上清液，按多功能凈化柱的操作說明進行凈化，收集全部凈化液，并確保凈化液多于

4mL。4.4.3.2 免疫親和柱凈化4.4.3.2.1 上樣液的準備用刻度移液管準確吸取上步的凈化液

4

mL

（茶湯樣品

20

mL

或依據濃度適當調整），加入

mL

含

的（使用甲醇-水溶液作為黃曲霉毒素提取溶劑時，加入含

1%

吐溫

-20

的PBS可減半加入），混勻。4.4.3.2.2 免疫親和柱準備將

2

℃～6

℃

條件下保存的免疫親和柱從冷藏條件下取出，恢復至室溫連接于固相萃取裝置。4.4.3.2.3 親和層析凈化待免疫親和柱內原有液體流盡后，將上述樣液（4.4.3.2.1）移至

50

mL

注射器筒中

（或按照批次分批次移入

10

mL-20

注射器筒），調節(jié)下滴速度，控制樣液以每秒一滴的速度穩(wěn)定流過免疫親和柱。樣液流完后，向注射器筒內加入

10

mL

含

1%

吐溫

-20

的PBS，以每秒

2

滴的流速淋洗免疫和柱下部放置

5

mL

刻度試管，加入

2

mL

甲醇，以每秒1滴的速度洗脫免疫親和柱，再用空氣壓力泵

℃

1.0

mL

-水溶液（，），渦旋

30

秒溶解殘留物，過

0.22

μm

有機濾膜過濾，收集濾液待測。4.4.4 液相色譜參考條件高效液相色譜參考條件如下：a)

流動相：A

相：水；B

相：甲醇；b)

等梯度洗脫條件：A

相：；B

相：45%；c)

色譜柱：C18柱（柱長

mm

或

150

mm，柱內徑

mm，填料粒徑

5

μm)，或相當者；d)

流速：0.8

mL/min；e)

柱溫：40f)

進樣量：10

μL；g)

光化學柱后衍生器；h)

激發(fā)波長：360

nm；發(fā)射波長：440

nm；i)

液相色譜圖參見附錄

A。4.4.5 定性檢測試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準品色譜峰的保留時間相比較，變化范圍應在

±之內。4.4.6 標準曲線制作

??×??

(1)DB34/T

4268—

??×??

(1)在4.4.41、2、AFG1和AFG2色譜峰面積與各對應濃度作圖，得到標準曲線回歸方程，其線性相關系數應大于

0.99。4.4.7空白試驗有干擾待測組分的物質。分析結果計算與表述試樣中AFB1、2、1和2按照公式（1）計算出毒素濃度，計算結果保留三位有效數字，單位為（μg/kg

或

μ??

=

0)×??×??式中：C

——

試樣中1、AFB2、AFG1或2的含量，單位為微克每千克或微克每升（μg/kg或μρ

——

標準工作液中黃曲霉毒素的濃度，單位為納克每毫升；A

——

樣液中黃曲霉毒素的峰面積；A0

空白樣液中黃曲霉毒素的峰面積；V

——

樣液最終定容體積，單位為毫升（mLm

——

最終樣液所代表的試樣量，單位為克或毫升（g或AS

——

標準工作液中黃曲霉毒素的峰面積。精密度在重復性條件下，獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值，不得超過算術平均值的

。檢測限當稱取樣品

5

g（或50

）時，AFB1的檢出限為

0.04

μg/kgμg/L），2的檢出限為

0.02μg/kgμAFG1的檢出限為

0.04

μg/kg（或μg/LAFG2的檢出限為

0.02

μg/kgμ5第二法

雙柱凈化-液相色譜柱串聯質譜檢測法原理試樣中的1、AFB2、AFG1、AFG2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取，提取液用含

1%

吐溫

濃縮、定容和過濾后，經液相色譜分離，串聯質譜檢測。外標法定量。試劑和材料5.2.1 試劑同4.2.1。5.2.2 材料同4.2.2。DB34/T

4268—20225.2.3 試劑配制同4.2.3。5.2.4 標準品同4.2.4。5.2.5 標準溶液配制同4.2.5。儀器和設備5.3.1

高速粉碎機。5.3.2

渦旋振蕩器或搖床。5.3.3

天平：感量

0.01

g

和

g。5.3.4

渦旋混合器。5.3.5

空氣壓力泵。5.3.6

離心機：轉速≥6000

×g。5.3.7

固相萃取裝置：配

mL～50

免疫親和層析針筒。5.3.8

氮吹儀。5.3.9

篩網：1

mm～

2

mm

試驗篩孔徑。5.3.10

液相色譜-串聯質譜儀：帶電噴霧離子源。分析步驟5.4.1 取樣同4.4.1。5.4.2 提取同4.4.2。5.4.3 凈化同4.4.3。5.4.4 液相色譜參考條件高效液相色譜參考條件如下：a)

流動相：A

相：水；B

相：甲醇；b)

梯度洗脫：95%

A

0

～5

min），－35%

A

相（5

～

95%

A

min～

c)

色譜柱：C18柱（柱長

mm，柱內徑

2.1

mm；填料粒徑

μmd)

流速：0.4

mL/min；e)

柱溫：25f)

進樣體積：1.0

μL。5.4.5 質譜參考條件

c) ESI

+

c) ESI

+

H]

；1

313/定量離子

241

；

??×??

(2)質譜參考條件列出如下：a)

檢測方式：多離子反應監(jiān)測（b)

kV6

40

V；離子源溫度，℃；錐孔反吹氣流量，50

L/h；脫溶劑氣溫度，℃；脫溶劑氣流量，L/h；電子倍增電壓

650

V；++AFB2，母離子

315/定量離子

，定性離子

287；1，母離子

329/定量離子

243，定性離子215；2，母離子

331/定量離子

285，定性離子

；d)

總離子流圖：參見附錄

B；e)

子母離子掃描圖：參見附錄

C。5.4.6 定性檢測5.4.6.1 試樣中各目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間相比較，變化范圍應在±2.5%

之內。5.4.6.2 不超過規(guī)定的范圍（相對離子豐度

＞50%，允許相對偏差

≤；相對離子豐度

20%～50%偏差

≤25%；相對離子豐度

10%～20%，允許相對偏差

≤30%；相對離子豐度

≤，允許相對偏差≤50%）。5.4.7 標準曲線制作在5.4.4和5.4.5的液相色譜串聯質譜儀分析條件下，將標準系列溶液由低到高濃度進樣檢測，以AFB1、AFB2、AFG1和20.99。5.4.8 試樣溶液的測定及濃度范圍調整取5.4.35.5應在標準曲線線性范圍內，若超過線性范圍則應進行適當稀釋提取液或減少取樣量重新測定。5.4.9 空白試驗5.4.1～認不含有干擾待測組分的物質。分析結果計算與表述試樣中AFB1、2、1和2的峰面積，按照公式（2）計算出毒素濃度，計算結果保留三位有效數字，單位為（μg/kg或μ??

=

0)×??×??式中：C

——

試樣中1、AFB2、AFG1或2的含量，單位為微克每千克或微克每升（μg/kg或μρ

——

標準工作液中黃曲霉毒素的濃度，單位為納克每毫升；A

——樣液中黃曲霉毒素的峰面積；A0

空白樣液中黃曲霉毒素的峰面積；DB34/T

4268—2022V

——

樣液最終定容體積，單位為毫升（mLm

——

最終樣液所代表的試樣量，單