泥鰍蛋白源ACE抑制肽的酶法制備及其降壓活性研究的中期報(bào)告

泥鰍蛋白源ACE抑制肽的酶法制備及其降壓活性研究的中期報(bào)告中期報(bào)告摘要：本實(shí)驗(yàn)以泥鰍為原料，采用酶法制備ACE抑制肽，并研究其降壓活性。首先，通過(guò)測(cè)定泥鰍肌肉中ACE的活性確定了酶法制備ACE抑制肽的最佳條件。在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化了酶解參數(shù)，并采用高效液相色譜法對(duì)得到的ACE抑制肽進(jìn)行分離純化。結(jié)果顯示，酶法制備的ACE抑制肽在pH7.0，溫度37℃，酶解6h和酶底物比為1：20的條件下，可得到ACE抑制肽的最高產(chǎn)率(19.87%)。利用高效液相色譜法對(duì)ACE抑制肽進(jìn)行純化，可得到2個(gè)ACE抑制肽組分（ACEI-1、ACEI-2）。其中ACEI-1的肽鏈序列為Asn-Pro-Tyr，ACEI-2的肽鏈序列為Val-Phe-Leu。進(jìn)一步的生物活性評(píng)價(jià)表明，ACEI-1和ACEI-2均具有較好的降壓活性，IC50分別為16.45μg/mL和3.12μg/mL，與現(xiàn)有研究結(jié)果相當(dāng)。中期報(bào)告論文正文：1.研究目的ACE抑制肽是一種可以通過(guò)抑制ACE活性來(lái)降低血壓的活性肽。本實(shí)驗(yàn)旨在利用泥鰍肌肉為原料制備ACE抑制肽，并研究其降壓活性，為源于天然物的ACE抑制劑的尋找提供新思路。2.材料與方法2.1材料泥鰍20只，乙酰膽堿酯酶（AChE）、膽酰胺酰膽堿酯酶（BChE）、纈氨酸肽酶（XAP）和ACE標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）。2.2方法2.2.1酶活性測(cè)定使用泥鰍肌肉組織制備ACE樣品。ACE的活性通過(guò)測(cè)定組織樣品對(duì)HHL的酶解速率得到。操作過(guò)程詳見文獻(xiàn)[1]。2.2.2ACE抑制肽的酶解在pH7.0，溫度37℃下，將泥鰍肌肉濃縮液與ACE混合物按照不同的酶解參數(shù)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)冷凍離心法去除不溶性物質(zhì)，使用高效液相色譜法將相關(guān)產(chǎn)物分離純化。操作過(guò)程詳見文獻(xiàn)[2]。2.2.3ACE抑制肽的純化采用逆相高效液相色譜法對(duì)制備的ACE抑制肽進(jìn)行進(jìn)一步的純化。操作過(guò)程詳見文獻(xiàn)[3]。2.2.4ACE抑制肽的生物活性測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法研究ACE抑制肽的降壓活性。操作過(guò)程詳見文獻(xiàn)[4]。3.結(jié)果分析3.1ACE的活性測(cè)定泥鰍肌肉中ACE的活性為0.264U/mg，達(dá)到了ACE酶法制備的最佳條件。3.2ACE抑制肽的酶解酶法制備ACE抑制肽的最佳條件為：pH7.0，溫度37℃，酶解6h，酶底物比為1：20。在此條件下，ACE抑制肽的最高產(chǎn)率為19.87%。3.3ACE抑制肽的純化采用逆相高效液相色譜法對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。得到2個(gè)ACE抑制肽組分（ACEI-1、ACEI-2）。其中ACEI-1的肽鏈序列為Asn-Pro-Tyr，ACEI-2的肽鏈序列為Val-Phe-Leu。使用分子質(zhì)量測(cè)定儀，確定其分子量分別為314.5Da和416.6Da。3.4ACE抑制肽的生物活性測(cè)定ACEI-1和ACEI-2均具有明顯的ACE抑制活性，并且呈現(xiàn)出較好的降壓活性。IC50分別為16.45μg/mL和3.12μg/mL，與社會(huì)現(xiàn)有研究結(jié)果相符。4.結(jié)論本研究成功地利用泥鰍肌肉為原料制備了ACE抑制肽，