支原體污染-細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

支原體污染及防治從門外漢角度談—11支原體污染易被忽視1.培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁2.細(xì)胞病理變化輕微或不顯著3.細(xì)微變化也可由于傳代，換液而緩解。4.個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落22支原體高污染率國(guó)內(nèi)外研究表明，在細(xì)胞培養(yǎng)中，支原體感染率達(dá)到30-60%支原體污染已成為世界問(wèn)題！33333333支原體的生物特性◆是目前發(fā)現(xiàn)的最小細(xì)胞，直徑約為0.13-0.18μm。◆無(wú)細(xì)胞壁，不能維持固定的形態(tài)，變形能力大?！舾锾m氏染色不易著色或呈陰性?！舭ぶ泻心懝檀蓟蚱渌薮??！舳鄶?shù)支原體適合在偏堿性條件下生存（pH值7．6~8．0），對(duì)酸耐受性差。◆對(duì)熱比較敏感，對(duì)一般抗生素不敏感。4支原體污染的類型口腔支原體(M.orale)精氨酸支原體(M.arginini)豬鼻支原體(M.hyorhinis)發(fā)酵支原體(M.fermentans)梨支原體(M.pirum)萊氏無(wú)膽甾原體(A.laidlawi）5支原體污染的來(lái)源操作者無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、污染之培養(yǎng)基、血清、細(xì)胞等。操作室環(huán)境不佳、實(shí)驗(yàn)器具不潔。6科研人員的困惑有些實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅能在支原體陽(yáng)性的細(xì)胞中得到也曾有利用腫瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體實(shí)為針對(duì)所污染的支原體的抗體。還有的科研成果,他人無(wú)法重復(fù),也因所用細(xì)胞有支原體污染所致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)性和可靠性大大下降7支原體污染對(duì)細(xì)胞的影響

1、影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)支原體可使培液中支持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量減少，造成細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢甚至停止；另外還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞微管解聚，引起細(xì)胞一系列病變，表現(xiàn)為細(xì)胞收縮、貼壁細(xì)胞脫落、裂解等。8支原體污染對(duì)細(xì)胞的影響9

支原體污染對(duì)細(xì)胞的影響2.影響細(xì)胞的代謝和功能（1）培液中的精氨酸被支原體大量消耗，引起細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙；（2）支原體活動(dòng)使培液成分發(fā)生改變（如發(fā)酵型支原體降解糖類產(chǎn)生酸性物質(zhì)），影響細(xì)胞代謝。（3）支原體吸附在細(xì)胞表面，破壞細(xì)胞膜的完整性，影響細(xì)胞信號(hào)傳遞；10支原體污染對(duì)細(xì)胞的影響（4）支原體消耗細(xì)胞的核苷庫(kù)—染色體異常1112支原體污染對(duì)細(xì)胞的影響3、其他此外，支原體污染還會(huì)影響一些病毒在細(xì)胞中的產(chǎn)量、使惡性細(xì)胞致癌能力下降、影響淋巴細(xì)胞分化等。13支原體污染的檢測(cè)方法培養(yǎng)法DNA熒光染色法聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法電子顯微鏡法相差顯微鏡檢測(cè)3-H胸腺嘧啶摻入法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光法低張?zhí)幚淼匾录t染色觀察14支原體污染的常用檢測(cè)方法

1.培養(yǎng)法：原理是利用營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基,直接對(duì)待檢細(xì)胞、血清等進(jìn)行支原體培養(yǎng)。支原體集落呈“油煎蛋”樣缺點(diǎn)：靈敏度低，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，不能檢測(cè)到種且不適用于檢測(cè)所有支原體。15支原體污染的常用檢測(cè)方法DNA熒光染色法利用熒光Hoechst33258標(biāo)記細(xì)胞和支原體DNA,在紫外光(波長(zhǎng)為630nm)激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光,利用熒光顯微鏡觀察支原體是否存在。16支原體污染的常用檢測(cè)方法缺點(diǎn)：有時(shí)易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性17支原體污染的常用檢測(cè)方法PCR法：通過(guò)擴(kuò)增被檢測(cè)標(biāo)本中的支原體DNA,再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳完畢,將電泳膠在紫外投射儀下觀察,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量及陽(yáng)性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照條帶,觀察待測(cè)樣品中是否有陽(yáng)性條帶。18應(yīng)對(duì)支原體污染的策略一

細(xì)胞一旦發(fā)生了支原體污染,應(yīng)當(dāng)棄之。雖然已有了針對(duì)支原體的抗生素及最近出現(xiàn)的所謂支原體清除劑,這些方法只能殺滅細(xì)胞外的支原體。除非是不可替代或無(wú)法重新獲得的細(xì)胞一，般沒(méi)有必要進(jìn)行支原體清除工作。19支原體的清除方法20支原體的清除方法新一代支原體抗生素M-Plasmocin其含有兩種殺菌成分,一種成分通過(guò)干擾核糖體的翻譯功能而使蛋白合成受阻。另一種成分則通過(guò)干擾復(fù)制叉的形成而阻止DNA的復(fù)制。可以強(qiáng)效對(duì)抗支原體及相關(guān)的無(wú)胞壁的細(xì)菌,同時(shí)又不影響細(xì)胞本身的代謝,且處理過(guò)的細(xì)胞不會(huì)重新感染支原體,是目前對(duì)抗支原體最理想的方法。21M-Plasmocin支原體感染的細(xì)胞經(jīng)M-Plasmocin處理過(guò)的細(xì)胞22應(yīng)對(duì)支原體污染的策略二

1.從可靠來(lái)源引進(jìn)、使用細(xì)胞,特別是知名的信譽(yù)良好的專門機(jī)構(gòu),如ATCC、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心等,這些機(jī)構(gòu)對(duì)細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行一系列檢測(cè)。2.預(yù)防為主:細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定嚴(yán)格的管理制度,按照規(guī)范