分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用-基因表達(dá)

分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用（基因表達(dá)）基因表達(dá)

基因表達(dá)指基因組中某基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為mRNA和翻譯成蛋白質(zhì)的過程?；虮磉_(dá)的改變預(yù)示著細(xì)胞在分子水平上的變化。它往往是細(xì)胞形態(tài)功能變化之前的變化。DNARNAProtein轉(zhuǎn)錄翻譯影響基因表達(dá)的因素：1、遺傳因素個體差異，終生不變。2、環(huán)境因素

激素、藥物，細(xì)胞因子、機(jī)械刺激、病原體感染、電刺激、細(xì)胞轉(zhuǎn)化…..研究基因表達(dá)的手段1、RT-PCR(RNA)2、Northernblot(RNA)3、Westernblot(蛋白質(zhì)）4、免疫組化（蛋白質(zhì)）原位雜交、點(diǎn)雜交、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)基因芯片1、RT-PCR基本原理：將細(xì)胞中mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)PCR產(chǎn)物的量，判斷基因表達(dá)的強(qiáng)度。mRNAcDNAPCR產(chǎn)物RT-PCR是一種半定量方法實(shí)驗(yàn)操作：1）RNA提?。篢rizol試劑盒。

防止RNA降解RNA提取的成功與否是RT-PCR檢測中最重要的步驟。2)逆轉(zhuǎn)錄：RNA、緩沖液、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物（隨機(jī)引物，OligodT)5’AAAAAAAA3’TTTTTTTTmRNAcDNA3)PCR特異性引物、模板、Taq聚合酶。通過PCR，將目的片段擴(kuò)增幾十—百萬倍。在一定范圍內(nèi)和一定的條件下，PCR的產(chǎn)物量與模板量呈正比關(guān)系。循環(huán)次數(shù)產(chǎn)物量模板量4）幾個注意問題：反應(yīng)平臺內(nèi)參1、PCR效率差異，重復(fù)性2、內(nèi)參選定3、共同擴(kuò)增4、擴(kuò)增片段長度5、mRNA豐度，目標(biāo)片段與內(nèi)參片段iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)GAPDH(磷酸甘油醛脫氫酶)5)PCR產(chǎn)物量的測定

應(yīng)用圖象分析軟件進(jìn)行密度測定。目標(biāo)帶密度-背景密度內(nèi)參帶密度-背景密度=相對量處理后樣品相對量處理前樣品相對量=變化率100%160%ABCD2.02.02.01.02.02.01.01.0RT-PCR特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、特異性高、操作簡便。缺點(diǎn)：可靠性差、不能細(xì)胞定位。2、Northernblot標(biāo)記探針與膜固相RNA雜交。根據(jù)雜交信號強(qiáng)弱判斷表達(dá)量，根據(jù)雜交信號位置判斷分子長度。雜交信號實(shí)驗(yàn)操作：1）RNA提取2）RNA電泳（分離不同長度RNA)3）轉(zhuǎn)膜(形成固相RNA)4）探針標(biāo)記（同位素/非同位素）5）預(yù)雜交，雜交6）洗膜7）顯影（放射性/酶促）Northernblot特點(diǎn)：因?yàn)闆]有擴(kuò)增過程，Northernblot的結(jié)果可靠性高。可以確定未知基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）長度。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：1、操作煩瑣2、同位素3、靈敏度低4、對RNA質(zhì)量要求高5、不能定位細(xì)胞3、Westernblot標(biāo)記抗體與膜固相蛋白作用。根據(jù)信號強(qiáng)弱判斷蛋白表達(dá)強(qiáng)度。根據(jù)信號位置判斷蛋白分子量。標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白特異性反應(yīng)帶1）蛋白提取2）蛋白電泳（分離不同分子量蛋白）3）轉(zhuǎn)移4）封閉5）一抗作用6）標(biāo)記二抗（HRP/AP標(biāo)記）作用7）顯色實(shí)驗(yàn)操作：Westernblot特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：直接檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)量。缺點(diǎn)：靈敏度低一抗制備難度大，購買價格高容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)不能細(xì)胞定位4、免疫組化標(biāo)記抗體與組織細(xì)胞作用。根據(jù)信號強(qiáng)弱判斷表達(dá)強(qiáng)度，根據(jù)信號位置判斷表達(dá)細(xì)胞。eNOS表達(dá)（對照）（實(shí)驗(yàn)）實(shí)驗(yàn)操作1）組織切片（石蠟/冰凍）2）封閉，內(nèi)源性過氧化物酶失活3）一抗作用4）二抗（HRP標(biāo)記）作用5）顯色6）復(fù)染，封片免疫組化特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞定位缺點(diǎn)：定量不準(zhǔn)確，人為因素干擾大（圖象分析系統(tǒng)）5、基因芯片特定載體上密集的大量探針與熒光標(biāo)記的樣品反雜交。根據(jù)雜交信號強(qiáng)弱判斷基因表達(dá)強(qiáng)度?；蛐酒攸c(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：一次雜交可以得到大量表達(dá)信息。通用性好。缺點(diǎn)：成本高，需要專門設(shè)備。人類基因組計(jì)劃揭示了人類有3—4萬個基因，轉(zhuǎn)錄本多達(dá)10萬個。基因不同時