固定化微生物簡介及海藻酸鈉包埋固定法分析研究 環(huán)境工程專業(yè)

固定化微生物簡介及海藻酸鈉包埋固定法分析研究環(huán)境工程專業(yè)摘要：固定化微生物技術(shù)起始于1959年，由Hattori等人首次實現(xiàn)了大腸桿菌的固定化，此后發(fā)展迅速。該技術(shù)最初主要用于工業(yè)發(fā)酵，20世紀70年代以后，由于水污染嚴重，迫切需要一種高效、快速，能連續(xù)處理的廢水處理技術(shù)，從而微生物固定化技術(shù)才在污水處理中得到廣泛應(yīng)用[1]。固定化微生物技術(shù)是將微生物固定在載體上使其高度密集并保持其生物活性功能，在適宜條件下還可以增殖以滿足應(yīng)用之需的生物技術(shù)。在生物反應(yīng)器中所使用的微生物菌體往往被稱之為生物催化劑。由于在傳統(tǒng)的廢水生物處理工藝中，微生物通常是在水中以懸浮態(tài)生長的，因而易于從反應(yīng)器中流失，又由于其與水的密度差小，因此從流出的水中回收微生物進行重復(fù)利用將變得較為困難或復(fù)雜。為此，采用固定化技術(shù)，將微生物通過一定的技術(shù)手段是微生物固著生長，有利于提高生物反應(yīng)器內(nèi)微生物的數(shù)量，利于反應(yīng)后的固液分離，利于去除氮，取出高濃度有機物或難以生物降解物質(zhì)，提高系統(tǒng)的處理能力和適應(yīng)性，是一項高效低耗，運行管理簡單的廢水生物處理技術(shù)[2]。關(guān)鍵詞：固定化，載體，海藻酸鈉，細胞活性，前景1.引言下面介紹一下固定化微生物中的一些基礎(chǔ)知識，即固定化微生物的要求，載體的要求，以及載體種類，制備等。1.1被固定的微生物（主要是人為選定的特效降解菌的優(yōu)勢菌種）基本條件：①投加的菌體活性高；②菌體可快速降解目標污染物；③在系統(tǒng)中不僅能競爭生存，而且可維持相當(dāng)數(shù)量[1]。1.2固定化載體為微生物創(chuàng)造了更不易解體的生存環(huán)境，所以一個理想的固定化載體的選擇也很重要。適合于廢水處理的固定化載體應(yīng)具有以下性能：①對微生物無毒，生物滯留量高，不干擾生物分子的功能；②傳質(zhì)性能好；③具有足夠的機械、物理和化學(xué)穩(wěn)定性，不易被生物降解；④機械強度高，使用壽命長；⑤固定化操作簡單；⑥對其它生物的吸附??；⑦價格低廉[1]。1.3載體分類目前常用的載體可分為無機載體、有機高分子載體和復(fù)合載體3大類型。無機載體如多孔玻璃、硅藻土、活性炭、石英砂等。有機載體還可分為兩類：一類是高分子凝膠載體，如瓊脂、角叉萊膠和海藻酸鈣等；另一類有機合成高分子凝膠載體，如聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯醇凝膠、光硬化樹脂、聚丙烯酸凝膠等。復(fù)合載體是由無機載體和有機載體材料結(jié)合而成，使兩類材料的性能互補，從而顯示復(fù)合載體材料的優(yōu)越性[1]。1.4固定化微生物的制備方法

物理固定法主要有包埋法、吸附法（載體結(jié)合法）和包絡(luò)法，化學(xué)固定法包括共價結(jié)合法和交聯(lián)法（架橋法）[1]，又有自溶酶滅活法，絮凝吸附法[4]等。目前，國內(nèi)外學(xué)者對可用做包埋載體的有機物的研究較為廣泛，相關(guān)報道很多，但主要有聚乙烯醇、海藻酸鈉、聚丙烯酞胺、聚乙烯醇縮丁醛等幾類[1]。2.海藻酸鈉固定法2.1基本機理[5]海藻酸鹽是棕色藻類的胞內(nèi)產(chǎn)物，它由兩種不同類型的單糖組成，即1，4—β—D—甘露糖醛酸（M）和1，4——L—古洛糖醛酸（G）。海藻酸鹽是一種聚合物。海藻酸系天然有機高分子電解質(zhì)，其一價鹽(Na+,K+,NH4+)為水溶性鹽而二價以上的鹽(Ca2+,Al3+)為水不溶性鹽，因此可形成耐熱的凝膠或被膜，這是海藻酸鈉經(jīng)CaC12溶液鈣化后形成固定化凝膠的內(nèi)在機理。同時，海藻酸鈉易與蛋白質(zhì)、明膠等多種物質(zhì)共溶，并可與細胞混合形成均勻的懸浮液，使凝膠具有微生物分布的均勻性。除此之外，海藻酸鈉還具有價格低廉、水溶液粘度很大(1%的溶液可達200cp)、不易被大多數(shù)微生物降解等良好特性。由于組成海藻酸鹽單體的結(jié)構(gòu)中含有羧基和羥基能與金屬離子發(fā)生螯合作用，因此海藻酸鹽在包埋微生物的同時更可增加其吸附容量。海藻酸鈉與微生物的混合液與鈣離子發(fā)生的凝膠反應(yīng)主要在羧基上進行，用反應(yīng)式表示為:具體操作方法是:取一定量的濕菌體細胞，與濃度為3%的海藻酸鈉溶液混合均勻，然后滴入4℃的濃度為4%的氯化鈣溶液，形成直徑2-3mm的均勻小球，鈣化4h，然后用去離子水洗滌。2.2生產(chǎn)方法[6]A.C.Hulstl等曾經(jīng)報道了一種可以大量制作海藻酸鈣的方法，其實驗裝置，如圖1所示:此裝置靠機械帶動震針上下震動，向上時產(chǎn)生負壓吸入細胞懸浮液，向下運動則打出小球。根據(jù)海藻酸鈉-細胞懸浮液的密度、粘度、表面張力和所需小球的粒徑等條件，計算出震針的震動頻率和幅度。用此裝置一分鐘可產(chǎn)生400-500粒固定化顆粒，為這種固定化方法的工業(yè)化運用開辟了道路。用這種方法生成的小球在與磷酸、檸檬酸、EDTA和乳酸等溶液接觸后，海藻酸鈣凝膠顆粒會逐步解體。用聚乙烯亞胺(PEI)和戊二醛對包埋小球進行交聯(lián)強化可以有效地解決這一問題。先將固定化顆粒置于的PEI-CaC12混合溶液中，間歇攪拌24h，取出，用水洗滌，再置于戊二醛溶液中攪拌lmin，得強化固定化細胞顆粒。實驗表明最佳強化條件是:PEI濃度0.55%，戊二醛濃度1.0%,CaC12為50mmol/L,PEI-CaC12混合溶液pH=8.20。2.3固定化方法2.3.1實驗一[4]用海藻酸鈣包埋固定熱帶假絲酵母菌，在三相流床反應(yīng)器中連續(xù)處理含酚廢水，進水酚濃度為300mg/L，出水酚濃度小于0.5mg/L，分的最大容積負荷比活性污泥法高1倍，其污泥發(fā)生量僅為活性污泥法的1/10。2.3.2實驗二以海藻酸鹽為載體，建立包埋固定化微生物的方法如下[5]：方法I=1\*GB3①將海藻酸鈉加熱溶于水；=2\*GB3②將海藻酸鈉溶液與微生物細胞混合均勻，使海藻酸鈉最終濃度為2%~4%；=3\*GB3③將海藻酸鈉與菌體混合液用針形管滴入5%~10%的CaCl2溶液中，固定化7~8h；=4\*GB3④濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。方法II=1\*GB3①將按方法I制得的固定化細胞顆粒置于0.06mol/L的己二胺溶液中攪拌1~2h；=2\*GB3②濾出顆粒，水洗后，用0.5%戊二醛交聯(lián)5min；=3\*GB3③濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。方法III=1\*GB3①將按方法I制備的固定化顆粒浸泡于下列溶液中：殼聚糖0.5%CaCl20.2mol/LpH6.0=2\*GB3②濾出顆粒，水洗后，用0.5%戊二醛交聯(lián)5min；=3\*GB3③濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。分別利用以上三種固定化方法，包埋黑曲酶細胞，比較各種固定化細胞的活性，其結(jié)果如表1：表1海藻酸鈣包埋法的比較固定化方法方法I方法II方法III固定化細胞相對活性57.1%52.9%44.8%由表1可以看出，用海藻酸鈉系列包埋固定化方法固定化微生物，固定化細胞的活性較高。其中用方法I固定化細胞的活性最高，在方法II、III中，由于在海藻酸鈣凝膠表層突上了一層高分子膜，雖然增強了固定化顆粒的機械強度，但是同時加大了底物及氧的擴散阻力，從而降低了細胞活性。此外，在方法II、III中所采用的戊二醛對細胞液具有毒性，在使用前應(yīng)作毒性試驗，確定是否采用改種交聯(lián)劑。2.4海藻酸鈉包埋法固定化試劑對細胞活性的影響2.4.1海藻酸鈉對細胞活性的影響海藻酸鈉是一類天然高分子多糖類，對微生物沒有毒害作用。但海藻酸鈉的濃度會影響固定化細胞的機械強度、質(zhì)量傳遞等，進而影響到微生物的活性。海藻酸鈉濃度對固定化細胞活性的影響如表2所示。表2海藻酸鈉濃度對細胞活性的影響海藻酸鈉濃度細胞相對活性成球難易海藻酸鈉濃度細胞相對活性成球難易1.0%56.2%易2.5%52.3%易1.5%57.1%易3.0%45.6%較難2.0%55.4%易2.4.2CaCl2濃度細胞活性的影響在海藻酸鈉包埋固定化過程中，凝膠化劑CaCl2中的Ca2+于海藻酸鈉根離子螯合形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，從而將細胞固定。CaCl2溶液的濃度對固定化細胞顆粒機械強度的影響見表3。表3CaCl2濃度對固定化細胞凝膠機械強度的影響CaCl2濃度/%234510機械強度較好較好較好好好隨著CaCl2濃度的增加，微生物細胞的活性降低。當(dāng)CaCl2濃度低于5%時，細胞活性可以保持在80%以上；但是當(dāng)CaCl2濃度達到10%，細胞活性下降到60%左右，主要原因估計有兩種（=1\*romani）由于鹽的滲析作用，引起細胞脫水，致使微生物活性部分喪失；（ii）在PCR技術(shù)中，CaCl2是使細胞處于感受態(tài)的物質(zhì)，這個時候微生物是最脆弱的，很容易被外界的干擾破壞。從表四可以看出，CaCl2濃度對固定化細胞的機械強度影響較大。當(dāng)CaCl2濃度為2%~3%時，固定化顆粒在使用過程中會出現(xiàn)膨脹，甚至出現(xiàn)裂縫或破碎現(xiàn)象。因此，海藻酸鈣包埋法固定化細胞活性較高。3固定化細胞性能的評價3.1固定化顆粒的密度固定化顆粒是指一定體積內(nèi)固定化顆粒的量，因此，確定固定化顆粒的密度，也就是測定其體積和重量[2]。3.2固定化顆粒的通透性和機械強度固定化顆粒的通透性，是用來衡量的固定化細胞與外界交換能力的重要指標。通透性越好，固定化細胞與外界的物質(zhì)交換越容易，固定化微生物對于外界污染物的降解能力越強。機械強度，主要衡量固定化顆粒在外界的持續(xù)壓力沖擊下保持形狀的能力，一般來說，機械強度越大，顆粒可重復(fù)利用率越高，在工程上的應(yīng)用價值越大。但是在固定化過程中，固定化時間越長，顆粒的機械強度越大，通透性卻降低；反之，固定化時間越短，通透性提高，機械強度卻無法保證。因此，在實驗中應(yīng)該綜合考慮兩個因素，在兩個指標中尋找最優(yōu)的組合[5]。3.3固定化顆粒的最適溫度、最適pH值由于在存在狀態(tài)上與游離的微生物不同，因此在最適溫度和最適pH值方面也會有很大的不同。通過做對照試驗，測出不同組別在不同溫度和pH值的條件下降解速率，從而找出最佳的降解的溫度和pH值?？梢钥吹?，在固定化以后，微生物可以存在的溫度和pH值范圍比固定化以前有了顯著的擴大[5]。3.4微生物的包埋量由于在制作固定化顆粒的過程中，不可避免的會有一部分微生物沒有包埋到顆粒之中，這部分微生物不會參加對污染物的降解，因而在一定程度上會影響降解的效果。因此包埋量的測定也是評價固定化好壞的一個很重要的指標。4.總結(jié)4.1通過實驗一和實驗二可以看出海藻酸鈉包埋法操作簡單，而且發(fā)展出了適合大規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)，海藻酸鈉可比較廣泛的應(yīng)用于固定化，這就使此方法有較大的應(yīng)用范圍。海藻酸鈉溫和無毒，固定化的細胞容易適應(yīng)，適合于固定活細胞或敏感細胞。用海藻酸鈉與氯化鈣交聯(lián)生成的海藻酸鈣固定包埋的微生物保持了較高的生物活性，但是在含有多價陰離子以及高濃度電解質(zhì)溶液中比較不穩(wěn)定，Ca2+容易脫落，包埋強度也隨著鈣離子的脫去而逐漸變?nèi)?，最后可能出現(xiàn)破損的現(xiàn)象。當(dāng)存在高濃度的K+、Mg2+、磷酸鹽以及其他單價金屬離子時，海藻酸鈣凝膠的結(jié)構(gòu)也易受到破壞。除此之外，由于海藻酸鈣凝膠網(wǎng)格的孔隙太大，酶可能會從網(wǎng)格中滲露出來。這是將其廣泛應(yīng)用于大規(guī)模廢水處理所急需解決的問題，而在實際應(yīng)用中常常添加其它添加物以增加其強度。4.2從固定化微生物技術(shù)誕生之初到現(xiàn)在，固定化微生物技術(shù)有了長足的發(fā)展，特別是在處理廢水領(lǐng)域，相應(yīng)的理論構(gòu)造己發(fā)展成型、并積累了很多寶貴的經(jīng)驗。目前的現(xiàn)狀如下:(1)厭氧微生物利用較多(2)固定化方法中以膠體包埋法為多(3)厭氧處理常用固定床，好氧處理多用流化床(4)適于在高負荷條件下運轉(zhuǎn)(5)剩余污泥產(chǎn)生量少(6)對水質(zhì)水量變化的適應(yīng)性能力強[7]同時固定化微生物技術(shù)存在的許多急需解決的問題也顯現(xiàn)出來:(1)廉價高效的固定微生物載體的開發(fā)(2)提高載體的重復(fù)使用率，延長使用壽命，降低使用成本(3)適合特定處理的微生物種群的選擇(4)開發(fā)新型高效的固定化微生物反應(yīng)器[1](5)混合固定化技術(shù)的進一步研究和開發(fā)(6)開發(fā)成型的固定化微生物（細胞）傳感器[2]廣泛應(yīng)用在處理氨、氮廢水，固定化活性污泥除BOD物質(zhì)，難降解有機廢水（含酚廢水，含芳香烴廢水，處理LAS廢水，處理重金屬廢水）等。固定化微生物方法在污水處理中較物理法，化學(xué)法等有著明顯的優(yōu)勢，如克服了生物細胞太小，與水溶液分離困難，易造成二次污染缺點等缺點，而有著效率高、穩(wěn)定性強、能純化和保持高效穩(wěn)定濃度菌種等優(yōu)點。同時，也有著明顯的不足，如缺乏廉價優(yōu)良載體，在文中海藻酸鈉包埋法中有著很好的生物活性但卻也有包埋強度較差的劣勢，其他還有需嚴格控制微生物生長環(huán)境等。優(yōu)良菌種的選擇，高活性高強度載體的出現(xiàn)，新的包埋方法的研究都將促進固定化微生物技術(shù)在污廢水處理中的應(yīng)用[8]。參考資料：[1]高紅梅,固定化微生物技術(shù)及其在養(yǎng)殖水體中的應(yīng)用,中國飼料行業(yè)信息網(wǎng),/tech/biotech/200509/8208