薄層色譜法標準操作規(guī)程課件

薄層色譜法標準操作規(guī)程

薄層色譜法標準操作規(guī)程薄層色譜原理薄層色譜法，是將適宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均勻薄層。等點樣、展開(吸附、解吸附的過程)后，與適宜的對照物按同法所得的色譜圖作對比，用以進行藥品的鑒別，雜質(zhì)檢查或含量測定的方法。薄層色譜法標準操作規(guī)程薄層色譜分類在薄層色譜分析中，主要是動相溶劑（展開劑）帶動混合物組分流經(jīng)靜相（即薄層板）的過程。根據(jù)靜相的性質(zhì)，使被分離的組分基于以下的一種或幾種因素，在動相與靜相間進行分配，從而達到分離的目的（1）在靜相的表面或內(nèi)部所持有的液體中進行溶解分配---分配薄層色譜（2）在靜相的表面或孔隙中進行吸附分配。

---吸附薄層色譜

---凝膠過濾薄層色譜（3）與靜相的離子組分形成極性鍵

---離子交換色譜薄層色譜法標準操作規(guī)程色譜條件1靜相物質(zhì)（吸附劑、粘合劑、附加劑）的選擇。纖維素、淀粉硅酸鎂硫酸鈣

硅膠佛羅里硅土氧化鎂

氧化鋁活性炭對極性有機物的吸附作用增強薄層色譜法標準操作規(guī)程常用靜相物質(zhì)的一般性質(zhì)

名稱酸堿性吸附活性分離原理硅膠氧化鋁硅藻土硅酸鎂氫氧化鈣磷酸鈣氫氧化鐵活性碳纖維素聚酰胺離子交換纖維素多聚葡萄糖膠酸性堿性中性——堿性微堿性————中性中性堿性-酸性——強強無弱弱強強強無無無無吸附；分配吸附；分配分配吸附吸附吸附吸附吸附分配吸附離子交換凝膠過濾薄層色譜法標準操作規(guī)程常用吸附劑及其特性薄層色譜法標準操作規(guī)程

硅膠是由硅膠酸脫水而成，是薄層色譜中應用最多的一種吸附劑。硅膠顆粒表面有大量的—OH基，帶有一定的酸性（pH4—5），故適于酸性或中性物質(zhì)的分離。硅膠又有很強烈的吸濕性，故相對來說，硅膠更適于分離疏水性物質(zhì)，而分離親水性物質(zhì)的效果較差。（1）硅膠薄層色譜法標準操作規(guī)程常見的商品硅膠有以下幾種規(guī)格：1）不加粘合劑的純硅膠粉：商品稱硅膠H或硅膠N。2）加粘合劑的硅膠：加有15%石膏的硅粉膠，商品稱為硅膠G。加有15%淀粉的硅膠，商品稱硅膠S。3）含熒光指示劑的硅膠：這類硅膠粉含有無機熒光性物質(zhì)，如硫化鎘等，在短波紫外線照射下，產(chǎn)生綠色熒光，商品稱為硅膠GF254、硅膠Guv254或硅膠HF254。4）高純薄層硅膠：商品稱硅膠G—HR及硅膠HF—HR。薄層色譜法標準操作規(guī)程

氧化鋁為應用范圍僅次于硅膠的一種薄層吸附劑，吸附力很強。商品氧化鋁多為堿性（約pH9），但也有中性（約pH7）、酸性（約pH4）氧化鋁。氧化鋁薄層板主要用來分離堿性和中性的弱極性化合物常用的氧化鋁有：1）不加粘合劑的氧化鋁：商品稱氧化鋁H，或氧化鋁N。2）加粘合劑的氧化鋁：加有石膏的氧化鋁商品稱為氧化鋁G。3）含有熒光指示劑的氧化鋁：商品稱氧化鋁GF254，氧化鋁HF254亦有稱氧化鋁Guv254

（2）氧化鋁薄層色譜法標準操作規(guī)程

硅藻土為粗二氧化硅的水合物，由硅藻類的遺骸在海底堆積而成。它的吸附力極弱，但有大量的空腔，因此可以作分配薄層色譜中的惰性支持劑（擔體），用來分離親水化合物。（3）硅藻土薄層色譜法標準操作規(guī)程（4）聚酰胺粉：聚酰胺為內(nèi)酰胺的多聚體，其分子內(nèi)存在著很多酰胺鍵，可與酚類、酸類等化合物形成氫鍵，酰胺鍵內(nèi)的胺基又可與芳香硝基及醌式化合物中的醌基形成氫鍵，因此對這些化合物產(chǎn)生了一定的吸附作用，這些化合物與聚酰胺形成氫鍵能力各不相同，故用聚酰胺薄層板可達到分離效果。聚酰胺的粘著能力比其它吸附劑差，故需加入纖維素或淀粉等粘合劑薄層色譜法標準操作規(guī)程

含有大量的β—1，4葡萄糖甙鏈連接的纖維二糖，由於它含有大量的羥基，使得纖維素有良好的親水性，因此適用于分離親水性化合物。纖維素薄層板屬于分配色譜。（5）纖維素薄層色譜法標準操作規(guī)程（6）離子交換纖維素

在離子交換薄層色譜中，常用的靜相物質(zhì)為離子交換樹脂及離子交換纖維素，后者是將天然纖維素經(jīng)過酯化、醚化，使纖維中的羥基與一些酸性或堿性基團作用，形成有離子交換性質(zhì)的纖維素，這些物質(zhì)對於高分子量化合物的分離效果很好薄層色譜法標準操作規(guī)程（7）親水性凝膠

多聚葡萄糖凝膠為這一類物質(zhì)的代表，為一種多聯(lián)多聚葡萄糖，廣為應用在凝膠過濾薄層色譜薄層色譜法標準操作規(guī)程

動相溶劑薄層色譜中展開溶劑的選擇，對於成功地進行薄層分離是非常重要的。一般說來，中等極性的被分離物質(zhì)，需用中等活性的吸附劑及中等極性的展開溶劑；非極性的被分離物質(zhì)，需要用高度活性的吸附劑及非極性展開溶劑；極性的被分離物質(zhì)，用低活性的吸附劑及強極性的展開溶劑。展開溶劑的選擇要考慮到被分離物質(zhì)極性的強弱，而這種極性與化合物結(jié)構(gòu)有相當密切的關系。各種官能團的極性，按下列順序遞增。-CH2-CH2-＜CH=CH-＜OCH3＜-COOR＜=C=O＜-CHO＜—SH＜-NH2＜-OH＜-COOH薄層色譜法標準操作規(guī)程2動相物質(zhì)（展開劑）的選擇正己烷環(huán)己烷四氯化碳甲苯氯仿正丁醇乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水溶劑的洗脫能力隨溶劑的極性增大而增強在一塊薄層板上進行試驗：若所選展開劑使混合物中所有的組分點都移到了溶劑前沿，此溶劑的極性過強；若所選展開劑幾乎不能使混合物中的組分點移動，留在了原點上，此溶劑的極性過弱。理想的展開劑應能使混合物分離后各組分的Rf值相差盡可能大。各組分理想的比移值在0.2-0.8之間。當一種溶劑不能很好地展開各組分時，常選擇用混合溶劑作為展開劑。先用一種極性較小的溶劑為基礎溶劑展開混合物，若展開不好，用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調(diào)整極性，再次試驗，直到選出合適的展開劑組合。

薄層色譜法標準操作規(guī)程薄層色譜中展開溶劑的選擇，可采用以下兩種簡單的預試法：（一）微薄層法：用普通薄層板，在展缸中展開約5厘米，取出吹干后顯色。若混合物能分離為各個單獨的色斑，則展開溶劑可用。（二）微量圓環(huán)法：將樣品溶液點在薄層板上，可同時點數(shù)點，每點間距2-3厘米。再用毛細管分別吸取待試展開溶劑，依次滴加在各樣品原點中，干后顯色。如某種溶劑將待分離混合物形成一個個分離明顯的同心圓環(huán)，則為較合適的展開溶劑。薄層色譜法標準操作規(guī)程常用儀器1）硅膠板（市場購買，不自己鋪板，以前用的是GF254，現(xiàn)在買的是HSGF254）2）點樣器：定性：內(nèi)徑為0.3mm管口平整的普通毛細管定量：微量注射劑。點樣直徑不超過5mm，點樣距離一般為1.5—2.0cm即可，應能使點樣位置正確集中。3）展開室：應使用適合薄層板大小的玻璃制薄層色譜展開缸，并有嚴密蓋子，除另有規(guī)定外，底部應平整光滑，應便于觀察。薄層色譜法標準操作規(guī)程4）顯色劑：可采用噴霧顯色，浸漬顯色或置適宜試劑的蒸氣中熏蒸顯色，用以檢出斑點。5）顯色裝置：噴霧顯色噴霧器用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細霧狀噴出；浸漬顯色可用專用玻璃器皿或用適宜的玻璃缸代替；蒸氣熏蒸顯色可用玻璃缸或適宜大小的干燥器代替。6）檢視裝置：為裝有可見光、短波紫外光（254nm）、長波紫外光（365nm）光源及相應濾片的暗箱，可附加攝像設備供拍攝用,暗箱內(nèi)光源應有足夠的光照度。薄層色譜法標準操作規(guī)程三薄層色譜操作1薄層板的制備吸附劑硅膠調(diào)制玻璃板涂布調(diào)制時慢慢攪拌，勿使產(chǎn)生氣泡。均勻涂布在玻璃板上，搖動攤平，晾干。使用前放入烘箱內(nèi)，在105-115℃左右烘干40-50min。冷卻后使用。粘合劑、添加劑薄層色譜法標準操作規(guī)程將樣品溶于低沸點的溶劑（乙醚、丙酮、乙醇、四氫呋喃等）配成溶液圖點樣示意圖2點樣樣品溶液的配制點樣

原料樣2≤點樣直徑≤4mm1cm≤點間距≤1.5cm1-2cm反應混合液樣薄層色譜法標準操作規(guī)程斑點在薄層板上的位置通常用比移值（Rf）表示。Rf值為斑點中心距原點的距離與溶劑展開前沿距原點距離的比值：斑點中心至原點的距離Rf=----------------------------溶劑前沿至原點的距離

Rf值是與物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)相關的數(shù)值，因此，在特定條件下為一常數(shù)。不同的物質(zhì)由于在特定色譜條件下的兩相間分配系數(shù)的差異，而有著不同的Rf值，這樣就達到薄層色譜分離的目的。薄層色譜法標準操作規(guī)程圖1薄層色譜展開示意圖被分離混合物組分一組分二薄層色譜法標準操作規(guī)程展開可以單行展開：向一個方向進行；也可以進行雙行展開：先向一個方向展開，取出，待展開劑完全揮發(fā)后，將薄層板轉(zhuǎn)動90°再用原展開劑或另一種展開劑進行展開。還可以多次展開：一次展開未達滿意分離時，可將薄層板干燥后再次用同一種溶劑展開，可重復多次，直到混合物分離為止原點12雙行展開薄層色譜法標準操作規(guī)程1-2cm展開示意圖3展開展開劑要接觸到吸附劑下沿，但切勿接觸到樣點。蓋上蓋子，展開。觀察展開情況。取出薄層板薄層色譜法標準操作規(guī)程上升法傾斜上行法下降法圖展開方式示意圖薄層色譜法標準操作規(guī)程畫溶劑前沿線觀察斑點記錄Rf值薄層色譜展開示意圖1h反應混合液樣原料樣2h反應混合液樣結(jié)論：反應結(jié)束薄層色譜法標準操作規(guī)程4顯色

A光學檢出法

a自然光（400~800nm）

b紫外光（254nm或365nm）

c熒光

一些化合物吸收了較短波長的光，在瞬間發(fā)射出比照射光波長更長的光，而在薄層上顯出不同顏色的熒光斑點（靈敏度高、專屬性高）

薄層色譜法標準操作規(guī)程B蒸汽顯色法

多數(shù)有機化合物吸附碘蒸氣后顯示不同程度的黃褐色斑點，這種反應有可逆及不可逆兩種情況，前者在離開碘蒸氣后，黃褐色斑點逐漸消退，并且不會改變化合物的性質(zhì)，且靈敏度也很高，故是定位時常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸氣氧化、脫氫增強了共軛體系，因此在紫外光下可以發(fā)出強烈而穩(wěn)定的熒光，對定性及定量都非常有利，但是制備薄層時要注意被分離的化合物是否改變了原來的性質(zhì)。薄層色譜法標準操作規(guī)程C物理顯色法用紫外照射后的薄層，使化合物產(chǎn)生光加成，光分解、光氧化還原及光異構(gòu)等光化學反應，導致物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如形成熒光發(fā)射功能團。發(fā)生熒光增強或淬滅及熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射波長發(fā)生移動等現(xiàn)象，從而提高了分析的靈敏度和選擇性。薄層色譜法標準操作規(guī)程D試劑顯色法

顯色方法a噴霧顯色：顯色劑溶液以氣溶膠的形式均勻的噴灑在紙和薄層。b浸漬顯色：揮去展開劑的薄層板，垂直的插入盛有展開劑的浸漬槽中，設定浸板及抽出速度和規(guī)定在顯色劑中浸漬的時間。薄層色譜法標準操作規(guī)程顯色試劑

A通用顯色劑1）重鉻酸鉀——硫酸一般有機物均能顯色，不同化合物顯示不同顏色。噴灑劑：5克重鉻酸鉀溶于100ml40%硫酸中。噴灑后加熱至150oC斑點出現(xiàn)。2）碘：檢查一般有機物3）碘蒸氣：在一個密閉玻璃皿先放入碘片，使缸內(nèi)空氣被碘蒸氣飽和將薄層或紙層放入缸內(nèi)數(shù)分鐘即顯色，有時在缸內(nèi)放一盛水的小杯，增加缸內(nèi)的濕度，可提高顯色的靈敏度。0.5%碘的氯仿溶液，取出揮發(fā)散過量的碘再噴1%淀粉的水溶液，斑點轉(zhuǎn)成藍色。4）碘—碘化鉀溶液：生物堿顯棕褐色。5%磷鉬酸乙醇溶液：噴后120oC烤，還原性物質(zhì)顯藍色，再用氨氣熏，則背景變?yōu)闊o色。薄層色譜法標準操作規(guī)程5）20%磷酸乙醇溶液：噴后120oC，還原性物質(zhì)顯藍色。6）堿性高錳酸鉀試劑：還原性物質(zhì)在淡紅背景上顯黃色。溶液I:1%高錳酸鉀溶液。溶液II：5%碳酸鈉溶液。溶液I和溶液II等量混合使用。7）中性0.05%高錳酸鉀溶液：易還原性物質(zhì)在淡紅背景上顯黃色。8）硝酸銀—氫氧化銨（Tollen’s--zoffaronl）試劑，噴后105oC烤5~10分鐘，還原性物質(zhì)顯黑色。溶液I：0.1N硝酸銀溶液。溶液II：氫氧化銨溶液。臨用前溶液I和溶液II以1：5混合。注意：放久則形成爆炸性的疊氦化銀。薄層色譜法標準操作規(guī)程9）硝酸銀——高錳酸鉀試劑：還原性物質(zhì)在蘭綠色背景上立即顯黃色。溶液I：0.1N硝酸銀溶液：2N氫氧化銨溶液：2N氫氧化鈉（1：1：2）。臨用前配制。溶液II：高錳酸鉀0.5g，碳酸鈉1g，加水成100ml溶液。臨用前溶液I和溶液II等量混合。10）四唑試劑：還原性物質(zhì)，在室溫或微加熱時顯紫色。溶液I：0.5%四唑蘭甲醇溶液。溶液II：6N氫氧化鈉溶液。臨用前溶液I和溶液II等量混合。11）鐵氰化鉀：三氯化鐵試劑：還原性物質(zhì)顯蘭色，再噴射2N/L鹽酸溶液，則藍色加深。溶液I：1%鐵氰化鉀溶液。溶液II：2%三氯化鐵溶液。臨用前溶液I和溶液II等量混合。12）濃硫酸：甲醇（1：1）溶液，或5%硫酸的乙醇溶液，噴后100oC烤15分鐘，各種不同物質(zhì)顯不同顏色。薄層色譜法標準操作規(guī)程13）螢光顯色劑溶液：試噴以下一溶液，不同的物質(zhì)在螢光背景上可能顯黑色或其他螢光斑點。A：0.2%2.7——二氯螢光素乙醇溶液。B：0.01螢光素乙醇液C：0.1%桑色素乙醇溶液D：0.05羅丹明B乙醇溶液E：螢光素一溴，檢不飽和化合物。（1）0.1%螢光素乙醇溶液（2）5%溴的CCL4溶液。噴灑（1）以后，放置（2）溶液的缸內(nèi)，可在UV光下檢查螢光，螢光素與溴化合成曙紅（ensln）（無螢光），而光飽和化合物則與溴加成，保留了原來的螢光；若點樣量較多，則成黃色斑點，底板成紅色。薄層色譜法標準操作規(guī)程14）堿式醋酸鉛試劑（可做噴灑或沉淀試劑，多種有機化合物均反應）。取Pbo14g置乳缽內(nèi)，加蒸餾水10ml，研后成糊狀后，傾入玻璃瓶中，乳缽用10ml蒸餾水洗凈，洗液并入瓶中，加醋酸鉛溶液（取醋酸鉛22g，加蒸餾水70ml制成）70ml，用力振搖，放