DB21-T 3105-2019中國蛤蜊（種質(zhì)）

ICS67.120.30

B51

備案號：62042-2019DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3105—2019

中國蛤蜊（種質(zhì)）

SpeciesidentificationofMactrachinensis

DB21/T3105—2019

中國蛤蜊（種質(zhì)）

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范了中國蛤蜊Mactrachinensis（Philippi，1846）的名稱與分類、分布、主要形態(tài)特征、

生長與繁殖、遺傳學(xué)特性、檢測方法和判定規(guī)則。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于遼寧地區(qū)中國蛤蜊種質(zhì)檢測與鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T18654.2養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗第2部分：抽樣方法

GB/T18654.12養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗第12部分：染色體組型分析

DB21/T1958-2012水產(chǎn)動物DNA鑒定線粒體COI基因序列法

3名稱與分類

3.1名稱

中國蛤蜊Mactrachinensis（Philippi，1846），別名黃蜆子、飛蛤、沙蛤、中華蛤蜊、凹線蛤蜊。

3.2分類地位

軟體動物門（Mollusca）、雙殼綱（Bivalvia）、簾蛤目（Veneroida）、蛤蜊科（Mactrida）、

蛤蜊屬（Mactra）。

4分布

中國蛤蜊為暖溫性種類。棲息于中潮區(qū)至水深60m淺海的細(xì)砂中，以水深2m～5m處最多。主要分

布在我國的遼寧、山東，日本、朝鮮也有分布。

5主要形態(tài)特征

5.1外部形態(tài)特征

5.1.1貝殼外形

貝殼略呈三角形，殼較堅厚。殼長略大于殼高，兩殼大小相等。殼面膨脹，無放射肋，但由殼頂至

腹緣有寬度不等的淺黃色與黃褐色相間的放射帶或放射條紋。殼面同心狀，生長紋明顯，愈近腹緣生長

紋愈粗大。殼頂稍突出，略高出背緣，位于背緣中央稍偏前方，向內(nèi)彎曲，不接觸。小月面及楯面寬大。

殼前后緣均圓形，背腹緣呈弧形。

1

DB21/T3105—2019

5.1.2色澤

殼面黃褐色。殼內(nèi)面銀白色，殼頂內(nèi)面為藍(lán)紫色，幼貝更加明顯。

5.1.3絞合部

左右兩殼各具一主齒，左主齒呈“人”字形，右主齒呈“八”字形。左殼前后方各1齒，單片，右

殼前后方齒為雙片。內(nèi)韌帶槽位于殼頂基部，內(nèi)嵌有褐色三角形的內(nèi)韌帶，位于主齒后方。

5.1.4閉殼肌痕

后閉殼肌痕略大于前閉殼肌痕，在前后閉殼肌上方各有一縮足肌痕。

5.1.5外套肌痕

外套竇深而鈍。外套肌痕寬短。

中國蛤蜊外部形態(tài)見圖1。

圖1中國蛤蜊形態(tài)特征

5.2軟體部

5.2.1外套膜與水管

外套膜包圍整個軟體部，邊緣厚,中央薄而透明,在背緣愈合，并在后緣愈合形成兩個水管。水管短

而粗,兩個水管緊靠,但互不相通。出水管較進(jìn)水管細(xì)而短,于進(jìn)水管之上。

5.2.2足

位于身體腹面,兩側(cè)扁平呈斧刀狀,顏色為白色或淡紅色。

5.2.3閉殼肌

后閉殼肌大于前閉殼肌,略呈方柱形體，前閉殼肌近圓柱體，前后閉殼肌上方各有一縮足肌。

5.2.4鰓

身體左右各有鰓兩片，內(nèi)外鰓形狀不同,外鰓小于內(nèi)鰓，內(nèi)外鰓在背緣與內(nèi)臟囊相連，內(nèi)鰓的前端

與唇瓣相接，兩側(cè)鰓的基部在身體后部末端愈合。

5.2.5內(nèi)臟團(tuán)

2

DB21/T3105—2019

由肝胰臟、心臟、生殖腺、胃等構(gòu)成，被外套膜和鰓包圍。

6生長與繁殖

6.1生長

自然條件下，1齡殼殼長可達(dá)20mm～30mm。4齡或5齡時，殼長可達(dá)50mm～60mm。中國蛤蜊年齡、

殼長、體重之間的關(guān)系見表1。

表1中國蛤蜊年齡、殼長、體重之間的關(guān)系

年齡(年)殼長(mm)體重(g)

1<30<3.0

230～503.0～20

3～5016.7～25

4～6038.46～50

5～6038.46～50

6.2繁殖

6.2.1性成熟年齡

最小生物學(xué)年齡為1年。

6.2.2繁殖方式

雌雄異體,體外受精。極少數(shù)個體會發(fā)生性逆轉(zhuǎn),出現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象。

6.2.3繁殖期

每年只有一個繁殖期，繁殖盛期為5月中旬～8月上旬。其繁殖季節(jié)隨著地理區(qū)域不同而存在差異,

主要受水溫影響。

6.2.4排精、產(chǎn)卵習(xí)性

水溫14℃以上時，可以排精、產(chǎn)卵。排精和產(chǎn)卵時親貝雙殼微張，配子從出水管緩緩排出。精子

乳白色呈煙霧狀,卵子粉紅色呈絲縷狀。分批產(chǎn)卵，殼長45mm的雌性個體，1次產(chǎn)卵量在70萬?！?00

萬粒左右。卵沉性，排入水中的卵細(xì)胞不能立即自行散開。

6.2.5精卵特征

卵子呈圓球狀，核較小而居中。卵徑46μm～61μm，卵核徑20μm左右。精子頭部1.Oμm×l.7

μm，尾部細(xì)長，為頭部的1.0倍～1.5倍。受精后進(jìn)行不等全卵裂，從四細(xì)胞起為螺旋卵裂。

7遺傳學(xué)特性

7.1染色體數(shù)目

中國蛤蜊二倍體體細(xì)胞染色體數(shù)為：2n=38。

3

DB21/T3105—2019

7.216SrRNA、ITS2和COI基因片段分子特征

7.2.1線粒體16SrRNA基因片段單倍型序列位點

片段長度為322bp，檢測特征見圖2，片段的單倍型序列位點為：

“TAGTAGCGCAATAAATTGTCCTTTAATTGGGGAAATGAATGAAAGGGTTGACGAGGGGGAAGCTATCTTTTTGGTATAGTTTG

AAGTTTTCTTTTATGTGAAAAGACTTAGATTTTATAATTAGAAGAGAAGACCCCGGCGAGCTTGTTAAGGGTTACTAAGTTGAGGTAAT

TATTGATTTTTGTTGGGGCAACGCAAAGGGAAAAGAACTCCTTTGAGTTTTATAGGGATCCACTTAGAGTGAACAAAGCAAAAGCTACC

GCGGGGATAACAGCGCAATTTCTTCAGAGAGCTCATATCGAAGAGGAAGGTTGCGACCTCG”。

圖2中國蛤蜊肌肉組織16SrRNA基因片段凝膠電泳圖譜

7.2.2ITS2基因片段單倍型序列位點

片段長度為590bp，檢測特征見圖3，片段的單倍型序列位點為：

“ATCGACATCTTGAACGCATATTGCGGCTCCGGCTCAATGCCGAAGCCCCGCCTGTCCGAGGGTAGGCTAAACATAATCGCCCG

TATCTGCCTGTCGAGGCACCGTTTCATTACGGTGAATCCAGCGCAGGGGCGACTTGGCGTTTCGCGCGAGCCTGTCTCGCCCGTTCGCT

CGAGCTCTCCGCTCTCCCAGCAGGCCAACTCATTCAGTGGCGCAGGGACTGGGCCCGATCGGATCCAGTCTACCGTAGCTATCTGAAGG

TCTCGCTGCGTTCTGCCGCCGTCCCTCTCGCCTCTTCGTGAGGCTCGATCGAGGTTGATGGCCACGACTAGCGCAACCGGCTCGATGTA

CAGCACTCTCACTGCGGCTTACCAGCCGCGGAGGTCGAGGAGCACCACGTCGCCGGGGAGTAACCCGTTCTCGCTCACTAGTTCGCTAG

TAGCAGCTCGGGTTTGCGCGGTCTGTGCTTGGGGCAAGGAGCGGGCACCCAACCTATTCACTAGGTGAGTAGGCGGCGCACATAGTATA

AAACAACCTACCTCGGATCAGACGAGACTACCCGCTGAATTTAAGCATATCAGTAAGCGGAG”。

圖3中國蛤蜊肌肉組織ITS2基因片段凝膠電泳圖譜

7.2.3COI基因片段分子特征

片段長度為627bp，檢測特征見圖3，片段的單倍型序列位點為:

CATAAAGATATTGGCACTCTTTATTTCGTCTTTTCTTATTGGGCTGGGTTGGTAGGAACAGCTTTTAGCTCTATTATTCGTTTAG

AGTTAGCTGTTCCTGGTGAGAGTCTTTTAGATGGGCAGCTTTATAATTTAGTTGTGACGGCGCATGCTTTAGTTATAATTTTTTTTTTA

GTGATGCCAATAATGATGGGGGGTTTTGGGAATTGGTTAGTTCCTCTAATGTTAAAAGTTCCAGATATGAGGTTTCCTCGTATGAACAA

TATTAGGTTCTGACTTCTTCCTGTTTCTATTTTACTTCTATTTGCTTCGGCCTATGTTGAAAGAGGGGCAGGAACTGGTTGAACCATTT

ATCCTCCTCTGTCTAGGCATATAGGACATCCTGGACCGGCTATGGATTATGTTATTTTTTCTCTCCACGTAGGTGGTCTTTCTTCGATC

4

DB21/T3105—2019

CTAGCATCTATTAATTTCTTTACAACTTTCCTAAGGATACGACTAAAGGTGATGTCTTTATATCGGGTTCCTTTGTTTGTTTGATGTAT

TGCTGTAACTAGGTTCTTGTTAGTAGTTGCTATACCTGTTTTGGCTGGCGCTCTTACTATGTTGTTAACAGATCGGAATTTCAATACTT

CTTTTTTT。

圖4中國蛤蜊肌肉組織COI基因片段凝膠電泳圖譜

8檢測方法

8.1抽樣

按GB/T18654.2的規(guī)定執(zhí)行。

8.2染色體和核型檢測

8.2.1染色體標(biāo)本制備

參見GB/T18654.12的規(guī)定執(zhí)行。

8.2.2核型分析

觀察100個左右的分散良好的中期分裂相，記數(shù)確定二倍體數(shù)。從中挑選10個分散良好、形態(tài)清晰

的中期分裂相進(jìn)行顯微攝影、放大、測量，按GB/T18654.12的分類標(biāo)準(zhǔn)對染色體分類。

8.3線粒體基因片段分子特征檢測

COI基因片段分子特征檢測參照DB21/T1958-2012執(zhí)行。

16SrRNA和ITS2基因片段分子特征檢測如下。

8.3.1DNA提取

取足肌肉30mg，剪碎至糜狀，使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

8.3.2引物序列

以中國蛤蜊基因組DNA為模板，分別用無脊椎動物16SrRNA和ITS2基因序列通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。引

物序列見表1。

表1引物序列

5

DB21/T3105—2019

16S3L5’-TGAGCGTGCTAAGGTAGC-3’

16S4H5’-AGCCAACATCGAGGTCGC-3’

ITS2forwardprimer5’-CACACTGAACATCGACAGCTTG-3’

ITS2reverseprimer5’-GTTTCTTTTCCTCCGCTTACTG-3’

8.3.3PCR反應(yīng)體系

25μLPCR反應(yīng)體系組分見表2、3。

表225μL16SrRNA基因PCR反應(yīng)體系組分

PCRMix12.5μL

16S3L(10μM)0.5μL

16S4H（10μM）0.5μL

DNA模板(100ng/μL)1μL

H2O10.5μL

表325μLITS2基因PCR反應(yīng)體系組分

PCRMix12.5μL

ITS2forwardprimer(10μM)0.5μL

ITS2reverseprimer（10μM）0.5μL

DNA模板(100ng/μL)1μL

H2O10.5μL

8.3.4PCR程序

8.3.4.116SrRNA基因PCR程序

95℃預(yù)變性5min，之后30個循環(huán)（95℃變性30s，50℃退火50s，72℃延伸50s），經(jīng)72℃

延伸，10min后15℃保存。

8.3.4.2ITS2基因PCR程序

95℃預(yù)變性5min，之后30個循環(huán)（95℃變性50sec，48℃退火50sec，72℃延伸1min），經(jīng)

72℃延伸，10min后15℃保存。

8.3.5瓊脂糖凝膠電泳

8.3.5.1TAE（凝膠緩沖液和電泳緩沖液）的制備

Tris242g，Na2EDTA·2H2O18.6g，800mL去離子水，57.1mL的冰乙酸，用NaOH調(diào)pH至8.3，去

離子水定容至1L。使用時稀釋50倍。

8.3.5.2分析樣品的制備

電泳前取2μLPCR產(chǎn)物與0.8μL的上樣緩沖液混合后備電泳用。

8.3.5.3凝膠制備

6

DB21/T3105—2019

加瓊脂糖4g和制膠緩沖液（TAE）400mL，在三角燒瓶內(nèi)混勻，加熱至沸騰，然后注入制膠模具中。

冷卻后，保鮮膜密封保存?zhèn)溆谩?/p>

8.3.5.4電泳步驟

將Marker和PCR產(chǎn)物加入點樣孔，上樣完畢后，在室溫條件下以120V～150V電壓進(jìn)行電泳，電泳

時間依線粒體基因片段的不同而不同，當(dāng)PCR產(chǎn)物跑至凝膠1/2～2/3處即可。

8.3.5.5染色

電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠水平置于盛有3%EB的染色液的染色盒中進(jìn)行染色，染色15min左右。

8.3.5.6攝影、掃描

用凝膠成像系統(tǒng)對譜帶進(jìn)行顯像和拍照。

8.3.5.7結(jié)果分析

將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，采用雙向測序并對測序結(jié)果進(jìn)行人工校對。

9判定規(guī)則

被檢樣品符合本標(biāo)準(zhǔn)的第5章、第6章和第7章要求的為合格樣品。如果有一項不符合的可以復(fù)檢，

復(fù)檢不合格的判定為不合