第三章 發(fā)酵培養(yǎng)基

第三章發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基設(shè)計本章內(nèi)容常用培養(yǎng)基的基本要求培養(yǎng)基的成分及來源培養(yǎng)基的類型與區(qū)別發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計原理與優(yōu)化方法培養(yǎng)基：廣義上講培養(yǎng)基是指一切可供微生物細(xì)胞生長繁殖所需的一組營養(yǎng)物質(zhì)和原料。發(fā)酵培養(yǎng)基的作用：滿足菌體的生長促進(jìn)產(chǎn)物的形成培養(yǎng)基的共性①單位培養(yǎng)基能夠產(chǎn)生最大量的目的產(chǎn)物；②能夠使目的產(chǎn)物的合成速率最大；③能夠使副產(chǎn)物合成的量最少；④所采用的培養(yǎng)基應(yīng)該質(zhì)量穩(wěn)定、價格低廉、長期易于獲得；⑤所采用的培養(yǎng)基盡量不影響工業(yè)好氧發(fā)酵中的通氣攪拌性能以及發(fā)酵產(chǎn)物的后處理等。一、發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的基本要求發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基：是提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的，按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。一般設(shè)計適宜于工業(yè)大規(guī)模發(fā)酵的培養(yǎng)基應(yīng)遵循以下原則：

（1）必須提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分；（2）有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗，即提高單位營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率；（3）有利于提高產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力；（4）有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期；（5）盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的分離純化；（6）原料價格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易；（7）所用原料盡可能減少對發(fā)酵過程中通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率，降低能耗；二、培養(yǎng)基的成分及來源組成：碳源、氮源、水、無機鹽、生長因子、能源。碳源主要功能：一是提供微生物菌體生長繁殖所需的能源以及合成菌體所需的碳骨架；二是提供菌體合成目的產(chǎn)物的原料。常用：糖類、油脂、有機酸和低碳醇等。1糖類：發(fā)酵培養(yǎng)基中使用最廣泛的碳源。

純糖天然原料木糖單糖：葡萄糖雙糖：蔗糖、麥芽糖、乳糖

多糖：淀粉、糊精及其水解液糖蜜類：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜糖類：麥芽汁淀粉質(zhì)類：山芋粉、馬鈴薯粉、玉米粉、燕麥粉、木薯粉其它：纖維素水解液、乳清碳源物質(zhì)的易利用順序：(單)葡萄糖→(雙)蔗糖、麥芽糖、乳糖→(多)糊精→淀粉1.1葡萄糖常作為培養(yǎng)基的一種主要成份，并且作為加速微生物生長的一種速效碳源。但要注意葡萄糖效應(yīng)?！捌咸烟切?yīng)”是研究大腸桿菌利用各種不同混合碳源的時發(fā)現(xiàn)的碳分解產(chǎn)物的阻抑作用。當(dāng)大腸桿菌培養(yǎng)于含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中，菌體出現(xiàn)兩次生長旺盛期。葡萄糖效應(yīng)1.2糖蜜是制糖生產(chǎn)時的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物。糖蜜常用在酵母發(fā)酵和抗生素生產(chǎn)過程中作為碳源。在酒精生產(chǎn)工業(yè)中若用糖蜜代替甘薯粉，則可省去蒸煮、糖化等過程，簡化了酒精生產(chǎn)工藝。糖蜜使用的注意點：除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，其中有些是有用的，但是許多都會對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進(jìn)行預(yù)處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物質(zhì)：膠體成分（起泡、結(jié)晶）、鈣鹽（結(jié)晶）生物素（發(fā)酵控制）預(yù)處理：澄清→脫鈣→脫除生物素例：檸檬酸發(fā)酵有害物質(zhì)：鐵離子含量高（導(dǎo)致異檸檬酸的生成）1.3淀粉等多糖也是常用的碳源，它們一般都要經(jīng)過菌體產(chǎn)生的胞外酶水解成單糖后再被吸收利用，但通常也有將其經(jīng)過液化和糖化后再作為培養(yǎng)基的碳源使用。使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類。缺點：難利用、發(fā)酵液比較稠、成分比較復(fù)雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優(yōu)點：來源廣泛、價格低、可以解除葡萄糖效應(yīng)。2油和脂肪脂肪酶作用水解成甘油和脂肪酸進(jìn)一步氧化成CO2和H2O，并釋放出比糖類碳源代謝多得多的能量。缺點：比糖類代謝需要更多的氧。3有機酸有機酸的利用常會使發(fā)酵體系pH上升。

CH3COONa+2O2

2CO2+H2O+NaOH4烴和醇類

近年來隨著石油工業(yè)的發(fā)展，烷烴(一般是從石油裂解中得到的14～18碳的直鏈烷烴混合物，以及甲烷、乙烷、丁烷等)用于有機酸、氨基酸、維生素、抗生素和酶制劑的工業(yè)發(fā)酵中。氮源的種類無機氮源有機氮源氨基氮：

NH4OH(NH4)2SO4NH4NO3NH4Cl硝態(tài)氮：

NaNO3KNO3合成產(chǎn)物：尿素天然原料：植物蛋白：黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、菜籽餅粉、

麥麩、玉米漿、玉米麩質(zhì)粉動物蛋白：蛋白胨、魚粉、蠶蛹粉、牛肉膏微生物蛋白：酵母粉/浸膏、廢菌絲粉其它：酒糟等工業(yè)上常用的有機氮源都是一些廉價的原料或副產(chǎn)品。氮源氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和合成含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。1有機氮源由于有機氮源營養(yǎng)豐富，因而微生物在含有機氮源的培養(yǎng)基中常表現(xiàn)出生長旺盛、菌絲濃度增長迅速等特點。1.1玉米漿是玉米淀粉生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，是一種很容易被微生物利用的良好氮源。pH在4.0左右。1.2尿素成分單一，主要用于青霉素和谷氨酸生產(chǎn)。

有機氮源成分復(fù)雜可以從多個方面對發(fā)酵過程進(jìn)行影響，而另一方面有機氮源的來源具有不穩(wěn)定性。所以在有機氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響2無機氮源常用的無機氮源有銨鹽、硝酸鹽和氨水等。微生物對它們的吸收利用一般較快尤其是銨鹽氨水等比有機氮源的吸收要快得多，所以也稱之為速效氮源。無機鹽及微量元素1、作用：各種不一樣。2、來源：C、N源，以鹽的形式補充。3、用量：根據(jù)具體的產(chǎn)品，以實驗決定。4、使用注意點A.對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮。例：鐵離子青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20μg/ml

發(fā)酵罐必須進(jìn)行表面處理。B、使用時注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲酶NRRL-330,生產(chǎn)α-淀粉酶，pH對酶活的影響

pH酶活不加4.25120分鐘加K2HPO45.4530分鐘加KH2PO44.6275分鐘無機鹽及微量元素

1磷磷是核酸和蛋白質(zhì)的必要成份，也是重要的“生命通貨”——三磷酸腺苷（ATP）的組成成份。在代謝途徑的調(diào)節(jié)方面，磷元素起著很重要的作用，磷元素有利于糖代謝的進(jìn)行，因此它能促進(jìn)微生物的生長。但磷若過量時，許多產(chǎn)物的合成常受抑制。2鎂鎂處于離子狀態(tài)時，則是許多重要酶的激活劑，鎂離子不但影響基質(zhì)的氧化，還影響蛋白質(zhì)的合成。3硫硫存在于細(xì)胞的蛋白質(zhì)中，是含硫氨基酸的組成成份和某些輔酶的活性基。4鐵鐵是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過氧化氫酶的成份，因此鐵是菌體有氧氧化必不可少的元素。（為什么在培養(yǎng)基中一般見不到）5氯氯離子在一般微生物中不具有營養(yǎng)作用，但對一些嗜鹽菌來講是必需的。6鈉、鉀、鈣鈉離子與維持細(xì)胞滲透壓有關(guān)，故在培養(yǎng)基中常加入少量鈉。鉀離子也與細(xì)胞滲透壓和透性有關(guān)，并且還是許多酶的激活劑，它能促進(jìn)糖代謝。

鈣離子主要控制細(xì)胞透性。水

對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關(guān)重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大。

水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。對于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻對于常規(guī)發(fā)酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基中某些成份的加入有助于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，這些添加的物質(zhì)一般被稱為生長輔助物質(zhì)，包括生長因子、前體、產(chǎn)物抑制劑和促進(jìn)劑。生長因子從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。

有機氮源是生長因子的重要來源。前體前體指加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因其加入而有較大提高的一類化合物。用法：前體使用時普遍采用流加的方法

前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%

前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化；流加也有利于提高前提的轉(zhuǎn)化率產(chǎn)物合成促進(jìn)劑所謂產(chǎn)物合成促進(jìn)劑，是指那些細(xì)胞生長非必需的，但加入后卻能顯著提高發(fā)酵產(chǎn)量的一些物質(zhì)，常以添加劑的形式加入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的。有些促進(jìn)劑本身是酶的誘導(dǎo)物；有些促進(jìn)劑是表面活性劑，可改善細(xì)胞的透性，改善細(xì)胞與氧的接觸從而促進(jìn)酶的分泌與生產(chǎn)，也有人認(rèn)為表面活性劑對酶的表面失活有保護(hù)作用；有些促進(jìn)劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。三、培養(yǎng)基的類型與區(qū)別1斜面培養(yǎng)基要求：能使菌體生長快，產(chǎn)生孢子數(shù)量大、質(zhì)量好，且不會引起菌種變異。特點C、N源不宜多，否則只長菌絲，少長或不長孢子；無機鹽濃度要適當(dāng)控制，否則會影響孢子的顏色和孢子量。2種子培養(yǎng)基要求營養(yǎng)豐富、完全，氮和維生素的含量高些；培養(yǎng)基中加入一些易于吸收利用的快C、N源，便于孢子發(fā)芽生長；pH要穩(wěn)定；最后一級盡可能接近發(fā)酵培養(yǎng)基，常加入少量發(fā)酵合成期才大量需要的物質(zhì)。3發(fā)酵培養(yǎng)基目的：使接種菌絲生長并能高效表達(dá)，獲得高的發(fā)酵產(chǎn)量，同時組分盡可能單一，以保證高的得率。要求營養(yǎng)豐富完全，有利于產(chǎn)物合成；不能大量加入快C、快N源，應(yīng)和慢C、N源相結(jié)合；在產(chǎn)物分泌期間，pH穩(wěn)定；加入適量合成所需的物質(zhì)，如前體等，進(jìn)行定向發(fā)酵；采用中間補料，以提高發(fā)酵單位；原料的考慮——成本問題第四節(jié)

培養(yǎng)基的設(shè)計與篩選問題來了！交給你一個菌株，讓你拿出一個對該菌株最好的培養(yǎng)基配方，你如何做？一、培養(yǎng)基的設(shè)計培養(yǎng)基設(shè)計貫穿于發(fā)酵工藝研究的各個階段?無論是在微生物發(fā)酵的實驗室研究階段、中試放大階段還是在發(fā)酵生產(chǎn)階段，都要對發(fā)酵培養(yǎng)基的組成進(jìn)行設(shè)計。從理論上講，微生物的營養(yǎng)需求和細(xì)胞生長及產(chǎn)物合成之間存存著化學(xué)平衡，即：

碳源+氮源+其他營養(yǎng)需求→細(xì)胞+產(chǎn)物+CO2+H2O+熱量設(shè)計發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，就是使其營養(yǎng)成分滿足生成一定數(shù)量菌體細(xì)胞的需求；滿足生產(chǎn)一定量代謝產(chǎn)物的需求；滿足維持菌體生命活動提供能量的需求。根據(jù)以上方程式，可以推算滿足菌體細(xì)胞生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物的元素需求量嗎？不能！由于不同產(chǎn)生菌生理特性的差異、代謝產(chǎn)物合成途徑(特別是次級代謝產(chǎn)物合成途徑)的復(fù)雜性、天然原材料營養(yǎng)成分和雜質(zhì)的不穩(wěn)定性、滅菌對營養(yǎng)成分的破壞等原因，目前還不能完全從生化反應(yīng)來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方。設(shè)計一個合適的培養(yǎng)基需要大量而細(xì)致的工作。一般來說，需要根據(jù)生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等學(xué)科的基本理論，在參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗配方的基礎(chǔ)上，選用價格低廉的培養(yǎng)基原料，最大程度滿足菌體生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物的需要。設(shè)計培養(yǎng)基主要包括下列幾個步驟。(一)確定培養(yǎng)基的基本組成根據(jù)微生物的特性和培養(yǎng)目的，考慮碳源和氮源的種類，注意速效碳(氮)源和遲效碳(氮)源的相互配合。要避免某些培養(yǎng)基成分對代謝產(chǎn)物合成可能存在的阻遏或抑制作用。要注意生理酸性物質(zhì)和生理堿性物質(zhì)，以及pH緩沖劑的加入和搭配。對于不能合成自身生長所需要的生長因子的菌種，要選用含有生長因子的復(fù)合培養(yǎng)基或在培養(yǎng)基中添加生長因子。還要考慮菌種在代謝產(chǎn)物合成中對特殊成分如前體、促進(jìn)劑等的需要。要考慮原材料對泡沫形成的影響、原材料來源的穩(wěn)定性和長期供應(yīng)情況，以及原材料彼此之間不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(二)確定培養(yǎng)基成分的基本配比和濃度1．碳源和氮源的濃度和比例對于孢子培養(yǎng)基來說，營養(yǎng)不能太豐富(特別是有機氮源)，否則不利產(chǎn)孢子；對于發(fā)酵培養(yǎng)基來說既要利于菌體的生長，又能充分發(fā)揮菌種合成代謝產(chǎn)物的能力。碳源與氮源的比例是一個影響發(fā)酵水平的重要的因素。因為碳源既作為碳架參與菌體和產(chǎn)物合成又作為生命活動的能源，所以一般情況下，碳源用量要比氮源用量高。應(yīng)該指出的是：碳氮比也隨碳源和氮源的種類以及通氣攪拌等條件而異，因此很難確定一個統(tǒng)一的比值。碳氮比偏小，菌體生長旺盛，但易造成菌體提前衰老自溶，影響產(chǎn)物的積累；碳氮比過大，菌體繁殖數(shù)量少，不利于產(chǎn)物的積累。碳氮比合適，但碳源和氮源濃度偏高，會導(dǎo)致菌體的大量繁殖，發(fā)酵液黏度增大，影響溶解氧濃度，容易引起菌體的代謝異常，影響產(chǎn)物合成。碳氮比合適，但碳源和氮源濃度過低，會影響菌體的繁殖，同樣不利于產(chǎn)物的積累。除此以外，對于一些快速利用的碳源和氮源，要避免濃度過高導(dǎo)致的分解產(chǎn)物阻遏作用。2．生理酸性物質(zhì)和生理堿性物質(zhì)的比例生理酸性物質(zhì)和生理堿性物質(zhì)的用量也要適當(dāng)，否則會引起發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH大幅度波動，影響菌體生長和產(chǎn)物的合成。因此，要根據(jù)菌種在現(xiàn)有工藝和設(shè)備條件，生長和合成產(chǎn)物時pH的變化情況最適pH的控制范圍(一般霉菌和酵母菌比較適于微酸性環(huán)境，放線菌和細(xì)菌適于中性或微堿性環(huán)境)綜合考慮生理酸堿物質(zhì)及其用量，從而保證在整個發(fā)酵過程中pH都能維持在最佳狀態(tài)。第三節(jié)培養(yǎng)基的設(shè)計與優(yōu)化3．無機鹽濃度孢子培養(yǎng)基中無機鹽濃度會影響孢子數(shù)量和孢子顏色。發(fā)酵培養(yǎng)基中高濃度磷酸鹽抑制次級代謝產(chǎn)物的生物合成。4．其他培養(yǎng)基成分的濃度對于培養(yǎng)基中每一個成分，都應(yīng)考慮其濃度對菌體生長和產(chǎn)物合成的影響。二、培養(yǎng)基的篩選設(shè)計后的培養(yǎng)基要通過實驗進(jìn)行篩選驗證。大量的培養(yǎng)基篩選，一般采用搖瓶發(fā)酵的方法，這種方法篩選效率高，可在短時間內(nèi)從大量的不同組成的培養(yǎng)基中篩選到較好的培養(yǎng)基組成。但搖瓶的發(fā)酵條件與罐上的發(fā)酵條件還有較大的不同，故由搖瓶篩選出的培養(yǎng)基，還要通過實驗發(fā)酵罐的驗證，并經(jīng)過逐級放大實驗和培養(yǎng)基成分的調(diào)整才能成為生產(chǎn)用的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基篩選可以采用單因子試驗法。單因子試驗是逐個改變發(fā)酵培養(yǎng)基中某一營養(yǎng)成分的種類或濃度，分析比較產(chǎn)生菌的菌體生長情況、碳氮代謝規(guī)律、pH變化、產(chǎn)物合成速率等數(shù)據(jù)，從中確定應(yīng)采用的原材料品種和濃度。單因了試驗法工作量大，篩選效率低，需要時間長，故