細(xì)胞培養(yǎng)操作詳細(xì)

【細(xì)胞培養(yǎng)】一、細(xì)胞的復(fù)蘇：

非原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般凍存于液氮之中，需要培養(yǎng)時(shí)要先從液氮中取出使之復(fù)蘇。細(xì)胞復(fù)蘇的原則——快速融化：必須將凍存在－196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至371、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

1.1、將水浴鍋預(yù)熱至37℃2、取出凍存管及迅速解凍：

2.1、根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。

2.2、從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對管外的編號。

2.3、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化，約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。3、平衡離心將細(xì)胞懸液吸到離心管中，1000～1500rpm離心3分鐘；4、制備細(xì)胞懸液吸去上清液，加入10ml培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻，使細(xì)胞懸?。?、細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。6、培養(yǎng)細(xì)胞將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液吸到培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入37℃二、細(xì)胞的傳代：

培養(yǎng)的細(xì)胞生長至一定密度之后，由于培養(yǎng)液中營養(yǎng)逐漸消耗、代謝物逐步積累（可見到培養(yǎng)液變黃），而且細(xì)胞的生長空間也受到限制，就會影響到細(xì)胞的繼續(xù)生存。這時(shí)就需要分離出一部分細(xì)胞和更新培養(yǎng)液，這一過程就叫做傳代。1、貼壁細(xì)胞的傳代

具體操作如下：1.1、傳代前準(zhǔn)備：

1.1.1、預(yù)熱培養(yǎng)用液：把裝有培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃1.2、胰蛋白酶消化：

1.2.1、將瓶蓋過酒精燈火焰消毒后，打開瓶蓋，靠近酒精燈，小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗2－3次，沿壁（無細(xì)胞的一面）緩緩加入適量消化液（胰蛋白酶液），輕輕搖晃。注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最

佳消化溫度是37℃1.3、吹打分散細(xì)胞：

1.3.1、棄去大部分消化液（僅留少量在瓶內(nèi)），并輕輕拍打培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分散，然后加入新鮮的培養(yǎng)液，

再用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液（盡可能不要出現(xiàn)泡沫，否則對細(xì)胞有損傷〕1.4、分裝稀釋細(xì)胞

1.4.1、將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

1.4.2、倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要時(shí)計(jì)數(shù)。注意密度過小會影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。最后在瓶上做好標(biāo)記，如細(xì)胞代數(shù)、日期及姓名等。1.5、繼續(xù)培養(yǎng)：

1.5.1、用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時(shí)為一個(gè)＋，占50％為＋＋，占75％時(shí)為＋＋＋。2、懸浮細(xì)胞的傳代

懸浮細(xì)胞可以直接將培養(yǎng)瓶中的液體吸掉，只留下少量，然后加入新鮮培養(yǎng)液即可。當(dāng)細(xì)胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺到比較臟時(shí)，可以將懸液移到離心管內(nèi)，1000～1500rpm離心3分鐘，棄上清，加入約2ml培養(yǎng)液，吹打至均勻，滴加2-3滴至已加入新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（擰松培養(yǎng)瓶蓋）。三、細(xì)胞的凍存

細(xì)胞凍存的原則是要逐步緩慢降溫，以避免細(xì)胞內(nèi)部形成冰晶對細(xì)胞造成傷害。

1、具體操作如下：

1.1、從增值期到形成致密單層以前的細(xì)胞都可以用于凍存，但最好選擇對數(shù)增長期細(xì)胞，已長滿的細(xì)胞凍存復(fù)蘇后生存率低。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。

1.2、貼壁細(xì)胞經(jīng)消化、離心（1000～1500rpm，5min）收集，懸浮細(xì)胞經(jīng)離心收集；

1.3、大約106個(gè)細(xì)胞加入1ml凍存液（10％DMSO+90%血清），用吸管吹打，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液；

1.4、加入到凍存管中，每個(gè)凍存管加1－1.5ml的細(xì)胞懸液；密封；

1.5、在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱及凍存日期；

1.6、將凍存管直立放置于塑料盒或紙盒內(nèi)，管置于4℃半小時(shí)，然后置于-20℃兩小時(shí)，再置于2、注意事項(xiàng)：

2.1、使用DMSO前，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破華它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時(shí)最好戴上手套操作。2.2、不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～-60四、細(xì)胞計(jì)數(shù)

實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。

具體操作如下：1、準(zhǔn)備工作：取一瓶傳代的細(xì)胞，按上述二的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以使用。2、細(xì)胞懸液制備：細(xì)胞懸液的制備方法：用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等

平衡鹽溶液），吹打制成待測單細(xì)胞懸液。3、細(xì)胞計(jì)數(shù)：

2.1、蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。

2.2、制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸適量細(xì)胞懸液（如5滴）到一離心管中，加入等體積臺盼藍(lán)染液（0.4％）或苯胺黑，活細(xì)胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。若僅是單純的進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，不考慮細(xì)胞的活力，則可省略臺盼藍(lán)染色步驟。

2.3、、將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

2.4、統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大格（每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。

2.5、計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：

（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝（四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×2×104

說明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。

公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。

公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3；而1ml＝1000mm3細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：

①進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培

養(yǎng)液中；

②要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

③取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；

④數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。

⑤操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。注：4％臺盼藍(lán)母液的配制：

稱取4克臺盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃五、細(xì)胞活力的測定

1.染料排斥試驗(yàn)：

其原理是細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，某些染料可穿透細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞則能阻止該染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。借此可鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。常用的染料有臺盼藍(lán)、伊紅Y和苯胺黑等。

以臺盼藍(lán)染色為例。步驟同上述細(xì)胞計(jì)數(shù)的操作步驟。注意以下幾點(diǎn):

①計(jì)數(shù)：在3－10min內(nèi)，用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞（死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，活細(xì)胞則拒染）。

②臺盼藍(lán)染色時(shí)，時(shí)間不宜太長，否則活細(xì)胞也會著色，從而干擾計(jì)數(shù)。

③活細(xì)胞率（％）＝活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)＋死細(xì)胞總數(shù))×100％2、MTT比色實(shí)驗(yàn)：可測定測藥物或病毒的IC50

原理：活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶催化四甲基偶氮唑鹽(MTT)，還原成紫色不溶性結(jié)晶物，沉積于細(xì)胞中。用酸性異丙醇或DMSO溶解后，于酶標(biāo)儀上測定光吸收值。紫色不溶性結(jié)晶物形成的多少與活細(xì)胞數(shù)目和功能狀態(tài)相關(guān)。

2.1、將細(xì)胞接種于96孔板上，密度為大約105個(gè)/ml，每孔接種100μl；

2.2、培養(yǎng)至對數(shù)生長期加入待測樣品；

2.3、作用一定的時(shí)間之后，加入三蒸水配制的5μg/ml的MTT溶液，每孔20μl；

2.4、37℃六、細(xì)胞的運(yùn)輸

裝運(yùn)細(xì)胞的方法有兩種：

1、冷凍貯存運(yùn)輸

即利用特殊內(nèi)內(nèi)盛液氮或干冰凍存，保存效果較好，但較麻煩，且不能長時(shí)間運(yùn)輸，多需空運(yùn)。

2、充液法

2.1、選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，去掉培養(yǎng)液，充滿新培養(yǎng)液，液量要達(dá)到培養(yǎng)瓶頸部，擰緊螺帽或塞以膠塞，

保留微量空氣。若空氣留量過多，運(yùn)輸時(shí)大氣泡來回流動(dòng)對細(xì)胞有干擾作用。

2.2、妥善包裝、運(yùn)輸。一般在四五天內(nèi)到達(dá)目的地，對細(xì)胞活力無多大影響，時(shí)間過長則細(xì)胞活力下降。

2.3、到達(dá)目的地后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留維持細(xì)胞生長所需的液量，置37℃

【細(xì)胞轉(zhuǎn)染】一、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（Lipofetmiane2000）

1、轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的處理（以24孔板培養(yǎng)為例）：

貼壁細(xì)胞：在轉(zhuǎn)染前一天，在24孔板內(nèi)鋪上0.5×105細(xì)胞，500ul無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)一天，到轉(zhuǎn)染時(shí)使細(xì)胞達(dá)到80％～90％的匯合率。

懸浮細(xì)胞:在制備混合物前，將4—8×105細(xì)胞用無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)鋪鋪于24孔板內(nèi)。

2、轉(zhuǎn)染方法（以質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染為例）

2.1、將DNA質(zhì)粒溶于50ul無血清的Opti－MEMⅠReducedSerumMedium中。混合均勻。

2.2、將適量Lipofectamine2000溶于50ul無血清的Opti－MEMⅠ中，混合均勻。在室溫下孵育5分鐘（在25分鐘內(nèi)進(jìn)行步驟c）。

2.3、孵育5分鐘后，將上述兩種混合物混合（總體積100ul）。輕輕混合均勻在室溫下孵育25分鐘（可能出現(xiàn)霧狀沉淀）。復(fù)合無在室溫下六小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.4、在24孔板中每孔加入100ul的復(fù)合物以及適量培養(yǎng)基。十字法混合均勻。

2.5、細(xì)胞在37。CCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18－48個(gè)小時(shí)后，測量轉(zhuǎn)染效率。在加完復(fù)合物4－6小時(shí)候可更換培養(yǎng)基。3、轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)

3.1、轉(zhuǎn)染嚴(yán)格來說，每種細(xì)胞的條件是不一樣的，如果實(shí)驗(yàn)時(shí)，不能確定最佳轉(zhuǎn)染條件，請?jiān)诩?xì)胞實(shí)驗(yàn)組共享文件夾查找類似細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法；

3.2、轉(zhuǎn)染結(jié)果的好壞，與DNA質(zhì)量密切相關(guān)，務(wù)必在實(shí)驗(yàn)之前對去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA的質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格鑒定，至少采用以下兩種方法：瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度檢測，如果有條件，可對質(zhì)粒DNA去內(nèi)毒素質(zhì)量的進(jìn)行檢測。

細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作方法

【小量細(xì)胞樣品TotalRNA的提取方法】一、實(shí)驗(yàn)步驟（以細(xì)胞為例）

1.1、細(xì)胞樣品（1.0×107個(gè)）去上清之后，加入1mlTRIzol溶液反復(fù)吹打至溶液清亮，轉(zhuǎn)移入1.5mlTube中室溫下放置10min，如不能立即提取則放于-80℃保存（可保存一個(gè)月），提取時(shí)取出放于室溫融化；也可按照正常凍存方法保存1×107個(gè)細(xì)胞，提取時(shí)37℃迅速融化，5000rpm離心3min去除上清液后迅速加入1mlTRIzol溶液反復(fù)吹打至溶液清亮，室溫下放置10min；

1.2、加入200ul氯仿（1/5TRIzol體積），先用槍混勻10-15下，再充分顛倒混勻2min，使兩相充分混合，室溫靜置3min；

1.3、4℃、10000g（12000rpm）離心15min；

1.4、小心吸取上清（中間有厚厚的蛋白層）至一新的1.5mlTube中（可取干凈），加入0.5ml異丙醇（1/2TRIzol體積）先用槍混勻10-15下，再充分顛倒混勻2min，室溫放置10min；

1.5、4℃、10000g（12000rpm）離心10min；

1.6、小心吸去上清液（注意不要吸起白色沉淀），加入1ml70%乙醇（-20℃預(yù)冷）旋轉(zhuǎn)漂洗RNA沉淀；

1.7、4℃、10000g（12000rpm）離心5min；

1.8、小心吸去上清液，空氣中干燥2-3min，加入84ulDEPC水充分溶解RNA（如溶解困難，4℃放置過夜）；[將RNA稀釋5倍，電泳，]

（若是對RNA的質(zhì)量要求不高，做到這一步即可，以下是純化的步驟）

依次加入2ulRNaseInhibitor〈40U/ul〉，10ul10×DNaseIBuffer，4ulDNaseI〈RNaseFree〉〈5U/ul〉，充分混勻后37℃反應(yīng)60min；

1.9、補(bǔ)加200ulDEPC水至總體積300ul，再加入300ulPCI（DEPC水飽和），充分混勻5min，室溫10000g（12000rpm）離心10min；

1.10、小心取上清(幾乎看不見中間層，取的較干凈)于一新的1.5mlTube中，再加入300ulCI，充分混勻5min，室溫10000g（12000rpm）離心10min；

1.11、小心取出上清液(幾乎看不見中間層，取的較干凈)于一新的1.5mlTube中，加入30ul3MCH3COONa充分混勻1min后加入750ul無水乙醇（-20℃預(yù)冷），充分混勻2min，-20℃放置40min；

1.12、4℃、10000g二、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1.1、整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)該使用橡膠手套和口罩，實(shí)驗(yàn)前，使用70%乙醇擦拭雙手和工作臺以及實(shí)驗(yàn)用品；

1.2、實(shí)驗(yàn)用試劑必須保證質(zhì)量，對pH值有要求的必須以滅菌后的測量值為準(zhǔn)；

1.3、貴重的樣品，抽完之后，必須取出一定量作為實(shí)驗(yàn)室保存；

1.4、必要時(shí)，可以將槍頭剪掉一部分使用，以免RNA大量斷裂。

【PBS溶液的配制使用以及保存方法】一、試劑用途

實(shí)驗(yàn)中主要用來溶解稀釋固體試劑，形成含有緩沖體系的鹽離子溶液二、配制，使用和保存方法

1、溶液配制

按1L的標(biāo)準(zhǔn)量配制

稱取下列藥品：

NaCl8.0g

Na2HPO41.15g

KCl0.2g

KH2PO40.2g

溶解、定容，使用實(shí)驗(yàn)室用超純水；

2、除菌

實(shí)驗(yàn)室采用過濾滅菌，使用0.22μm的除菌膜；

4℃

【抗生素配制使用以及保存方法】一、原核細(xì)胞用抗生素

細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，為了防止培養(yǎng)過程中出現(xiàn)細(xì)菌污染，需要在培養(yǎng)基中添加雙抗，即青霉素和鏈霉素。

1、藥物使用濃度

根據(jù)細(xì)胞種類的不同，一般（P/S）的終濃度保持在100U/ml,具體的實(shí)驗(yàn)過程中，可以根據(jù)細(xì)胞對抗生素的敏感程度減少或增加雙抗用量，原則來說，抗生素的使用范圍為：50U/ml-200U/ml。

2、藥物配制方法（干粉狀的抗生素）

2.1、藥物溶解

使用少量的dPBS溶液溶解干粉狀的抗生素，溶解過程中，應(yīng)盡量減少dPBS的用量，使藥物保持在較高濃度；

2.2、溶液除菌

使用0.22μm的除菌膜過濾，然后分裝，-20℃保存。

2.3、日常使用

按實(shí)驗(yàn)要求的終濃度將抗生素溶液添加到培養(yǎng)基當(dāng)中，注意無菌操作。

2.4、注意事項(xiàng)

①總的原則是現(xiàn)用現(xiàn)配，盡量減少溶液反復(fù)凍融次數(shù)，防止抗生素失效；

②培養(yǎng)基最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，在含有血清的完全培養(yǎng)基中，添加抗生素，應(yīng)4℃保存且有效使用期不能超過1個(gè)月。

③抗生素并非越多越好，在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞條件不明確之前，應(yīng)該先從最小使用量開始。藥品保存溶液配制G418Preparedinahighlybufferedsolution(e.g.100mMHEPES,pH7.3,orcellculturemedium).

本實(shí)驗(yàn)室使用dPBS，pH7.3固體保存：SHELF(+20°C).Thisproductisstablefor2years

液體保存：Followingreconstitution,sterilizebyfiltrationthrougha0.22μmor0.45μmmporesizefilter,aliquotandfreeze(-20°C)forlongtermstorageorrefrigerate(+4°C)forshort-termstorage.assupplied.Sterilestocksolutionsarestableforatleast1yearat+4°C.HygromycinBSterile-filteredat50mg/mlactiveantibioticinPBS;Sterile-filteredat50mg/mlactiveantibioticin50mMHEPES,PH7.2.本實(shí)驗(yàn)室使用dPBS，pH7.3固體保存：Storageat4℃PuromycinSolubleinH2O（50mg/ml）ormethanol(20mg/ml)

本實(shí)驗(yàn)室使用dPBS，pH7.3固體保存：Freezer(-20℃).Protectfrommoisture.Followingreconstitution,sterilizebyfiltrationthrougha0.22umpore-sizefilter,aliquotandfreeze(-20℃).Thisproductisatablefor2yearsassupplied.

液體保存：Stocksolutionsarestableforupt