桉樹(shù)潰瘍病菌檢疫鑒定方法

桉樹(shù)潰瘍病菌檢疫鑒定方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了植物檢疫中桉樹(shù)潰瘍病菌Cryphonectriacabensis(Bruner)Hodges的檢疫鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于對(duì)來(lái)自疫區(qū)(參見(jiàn)附錄A第A.1章)的所有桉屬[Ewcalyprus]和桉樹(shù)潰瘍病菌其他寄主的原木、木制品(含木質(zhì)包裝)和苗木的檢疫鑒定。引起桉樹(shù)潰瘍病的病原為古巴隱叢赤殼Cryphoarctriacwlensis(參見(jiàn)附錄A第A.2章),該菌的寄主范圍(參見(jiàn)附錄A第A.3章)、植株癥狀(參見(jiàn)附錄A第A,4章)、侵染傳播(參見(jiàn)附錄A第A.5章)和病原形態(tài)(參見(jiàn)附錄A第A.6章)是該菌檢疫鑒定方法的依據(jù)。與Cryphonectriaspp.形態(tài)特征的區(qū)別主要依賴于子座的區(qū)別。子座特征可以將桉樹(shù)潰瘍病菌同Cryphonectria的模式種C.gyrwsu(Berk.&.Broome)Sace.以及該屬其他種如C.parasitica,C.radicalis,C.wacrospora和C.nitschkei區(qū)分開(kāi)。桉樹(shù)潰瘍病菌與桉樹(shù)上其他3種病原真菌的形態(tài)比較參見(jiàn)附錄A第A.7章。3試劑及主要儀器設(shè)備3.1培養(yǎng)基及試劑麥芽提取粉瓊脂培養(yǎng)基(MaltExtrnctAgar.MEA,20g/l.,Biolab公司》、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OatmealAgar,OA:燕麥粉30g,燕餾水8001,溶化成汁加入20g/LBiolab公司瓊脂中》,25%乳酸、1.25%次氯酸鈉(NaClO)、無(wú)菌水、75%酒精。3.2儀器與設(shè)備立體顯微鏡、生物顯微鏡(具油鏡和測(cè)微尺)、電子分析天平(感量0.001g),普通天平(感量0,1g)、超凈工作臺(tái)、生物培養(yǎng)箱、高壓滅菌器。4檢疫與鑒定4.1癥狀檢查檢查樹(shù)皮和木質(zhì)部之間是否有潰瘍層和黑色的圓錐狀分生孢子器。將抽取的原木、木制品或苗木用斧子或鋸子分別橫向和縱向切開(kāi)，仔細(xì)觀察橫斷面有無(wú)暗褐色扇形潰瘍班(參見(jiàn)附錄A第A.4章)。將有癥狀樣品帶回實(shí)驗(yàn)室作進(jìn)一步檢驗(yàn)。4.2室內(nèi)檢驗(yàn)4.2.1樣本形態(tài)鑒定觀察并記錄子實(shí)體(尤其是子座)的形態(tài)特征，從樹(shù)皮上采集子實(shí)體，然后在水中煮濾1min,以再水化細(xì)胞，切成12μm截面，置于乳酚或者3%氫氧化鉀中染色，觀察并記錄分生孢子或者子囊等部分的形態(tài)。共測(cè)量50個(gè)子囊孢子、子囊、分生孢子和產(chǎn)孢細(xì)胞的大小。至少分別計(jì)算10個(gè)無(wú)性階段和10個(gè)有性階段子座的測(cè)距。拍攝并保存數(shù)碼照片。1.25%次氯酸鈉表面消毒5min,無(wú)菌水沖洗3遍，放在直徑9cm的平板培養(yǎng)基上，每皿放4片～6片，于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，黑暗和光照各12h交替。待菌落出現(xiàn)，鏡檢并記錄培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落的形態(tài)特在MEA上菌落為白色，帶肉桂色至淡褐斑點(diǎn)，絨毛狀，邊緣平滑，生長(zhǎng)速度快，在30℃下覆蓋90mm直徑平板最少5d。皮表面130pm~740μm,直徑100gm～950μm,頸部長(zhǎng)230ym,寬90pm~240μm。分生孢子梗[參見(jiàn)囊座高出樹(shù)皮120gm～230μm,直徑280gm~490μm。每個(gè)子座1個(gè)～9個(gè)子囊殼，子囊殼[參見(jiàn)圖子囊[參見(jiàn)圖A.2g]]內(nèi)含8個(gè)孢子排成2列。單囊壁，無(wú)柄，擬紡錘形至精圓形，(25gm~34gm)×(4.0μm~6.5gm)。子囊孢子[參見(jiàn)圖A.2h]]透明，1個(gè)分隔，擬紡錘形至卵形，頂端漸縮，[(5.5)6.5pm~7.5(8.0)μm]×[2.0μm~2.5(3分離獲得的桉樹(shù)潰瘍病菌種，應(yīng)轉(zhuǎn)入燕麥瓊脂試管斜面上，置于15℃黑暗條件下保存至少12個(gè)(資料性附錄)核樹(shù)潰癌病菌的形態(tài)和生物學(xué)特性A.1核樹(shù)潰癌病菌Cryphonectriacubensis(Bruner)Hodges分布中美洲和加勒比海：哥斯達(dá)黎加、古巴，波多黎各、特立尼達(dá)和多巴哥。北美洲：美國(guó)(佛羅里達(dá)州、佐治亞州，夏威夷州)。大洋洲：澳大利亞、薩摩重群島。A.2學(xué)名及分類(lèi)地位古巴隱叢赤殼；Cryphomectriacwbensis(Bruner)Hodges(1980),異名CryptospovellacageniaeNutman&.F,M,Roherts(1952),DiaporthecabensisBruner(1917),EndothiaeugeniM.Roberts)J.Reid&.C.Booth(1969),Chrysoporthecadensis(Bruner)Gryzenh.古巴隱從赤殼Cryphomrctriacabeasis(Bruner)Hodges屬真菌界Fungi,子囊菌門(mén)Ascomycota,子囊菌綱Ascomycetes.間座殼目Diaporthales,Cryphonectriaceae科，隱叢赤殼屬Cryphomectria。丁香(Sy=ygiumaromaticgart),蒲桃(Sgrunulose.MicwriaA.4癥狀識(shí)別感病樹(shù)木的基部或地上1m處的樹(shù)皮下陷，樹(shù)皮下的組織呈褐色并明顯壞死，隨后，德染面周?chē)臉?shù)皮開(kāi)裂，一般潰瘍處可看到流膠。桉樹(shù)流膠是由于形成層受害而形成樹(shù)脂道。通常下剛時(shí)雨水沖洗患病組織使樹(shù)脂如紅寶石般明亮。感染樹(shù)木由于形成愈傷組織反應(yīng)，導(dǎo)致樹(shù)皮外層組織凸起，后來(lái)脫落而成潰瘍。也有些受侵染的樹(shù)皮形成層未死便已脫落，另一些則是破壞形成層引起典型的潰瘍，這時(shí)在原木橫斷面可觀察到一個(gè)暗褐色的扇形班。潰瘍的蔓延通常在樹(shù)干上部或偶爾在基部看到。由于韌皮部完全脫落導(dǎo)致樹(shù)木死亡，見(jiàn)圖A.1。圖A.1C.cubensis侵染巨桉癥狀及其分生孢子器(來(lái)源Giryzenhont2004)A.5侵染傳播病原菌主要通過(guò)傷口侵染，包括收割、剪枝、自然或意外損傷。病原菌侵染帶傷口的根或莖的組織后，病菌在樹(shù)木的皮層發(fā)育和擴(kuò)展，分生孢子器形成于皮層內(nèi)或表面，也可形成于剝離的樹(shù)皮外層組織中和自然裂縫。隨后形成子囊果。病原菌主要通過(guò)分生孢子傳播，其次為子囊孢子和菌絲體。高降水量(2000mm/a~2400mm/a),高海拔和高溫(23℃以上)有利于該病傳播。在干冷的地區(qū)，侵染的傳播范圍較小。菌絲或子實(shí)體也可隨樹(shù)皮、樹(shù)葉、根和莖等病殘?bào)w遠(yuǎn)距離傳播。A.6病原形態(tài)桉樹(shù)潰病病菌病原形態(tài)見(jiàn)圖桉樹(shù)潰病病菌病原形態(tài)見(jiàn)圖A.2.e)子囊果e)子囊果圖A.2桉樹(shù)潰瘍病菌病原形態(tài)5g)子囊g)子囊注1,a)標(biāo)尺200mm;b)~d),g>~h)注2:a),D來(lái)源Grgzenhout2003;b)~d),g)~h)來(lái)源GA.7桉樹(shù)潰病病菌Cryphonectriacwbeasis(Bruner)Hodges與桉樹(shù)上其他3種病原真菌的形態(tài)比較桉樹(shù)潰瘍病菌Crypbownectriucudensix(Bruner)Hotges與桉樹(shù)上其他3種病原真菌的形態(tài)比較見(jiàn)表A.1。1.分生孢子器(圖A.3))1.分生孢子器(圖