蘋果白絹病菌生物學特性及室內(nèi)藥劑毒力測定

收稿日期:;修回日期:基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0201100）,中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP）,中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項(1610182019017)第一作者：徐成楠（1981—），博士，副研究員，主要從事果樹病原真菌學及其綜合防控。Email:xuchengnan@通信作者：周宗山。Email:zszhouqrj@163.com蘋果白絹病菌生物學特性及室內(nèi)藥劑毒力測定徐成楠，遲福梅，冀志蕊，張俊祥，王娜，周宗山中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所,遼寧興城,125199摘要:在遼寧綏中縣發(fā)現(xiàn)蘋果白絹病發(fā)生為害，為明確病原菌種類，將采集病樣進行分離培養(yǎng)，并進行柯赫氏法則驗證致病性，根據(jù)病原菌形態(tài)和rDNA-ITS和LSU序列分析對病菌進行分子鑒定，同時進行了病菌生物學特性及防治藥劑毒力測定。結(jié)果表明，分離株的菌落形態(tài)與齊整小核菌SclerotiumrolfsiiSacc.一致，經(jīng)分子鑒定，其ITS序列和LSU序列與齊整小核菌的有性型序列同源性達100%，將引起蘋果白絹病的病原菌鑒定為齊整小核菌。病原菌在10~35℃均可生長，25~30℃時病菌生長最快，病原菌在pH值范圍為3~12時均可生長，堿性環(huán)境不適宜病菌生長。室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示，5種藥劑戊唑醇、吡唑醚菌酯、噻呋酰胺、咯菌腈和氟硅唑均對白絹病菌有抑制作用，其中，噻呋酰胺抑菌效果最好，EC50為0.0565mg/L。關鍵詞：蘋果白絹??；齊整小核菌；生物學特性；毒力測定我國是世界范圍內(nèi)蘋果生產(chǎn)大國，栽植面積及總產(chǎn)量均占全世界的50%左右，鮮食消費量和加工消費量逐年增長，蘋果出口位居世界前列[1]。遼寧省是我國渤海灣地區(qū)重要的蘋果產(chǎn)區(qū)之一，蘋果種植是省內(nèi)很多地區(qū)果農(nóng)主要的經(jīng)濟來源[2]。蘋果病害是影響我國蘋果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的限制性因素之一，在我國不同時期不同省份地區(qū)給果農(nóng)造成重大損失[3]。2016年我們針對遼寧省蘋果主產(chǎn)區(qū)9個區(qū)縣144個蘋果園進行病害發(fā)生情況調(diào)研，結(jié)果表明遼寧省蘋果栽培中主要病害為蘋果樹腐爛病、枝干輪紋病、斑點落葉病和炭疽葉枯病等[2]。然而，隨著矮砧密植種植模式在遼寧省的廣泛興起，部分蘋果園矮砧幼樹及近成齡樹發(fā)生的次要病害呈逐年上升趨勢。我國蘋果栽培中鮮有關于蘋果白絹病的發(fā)生報道，近年來僅有山東部分地區(qū)的科研及技術(shù)推廣部門初步報道了該病害的發(fā)生及防治[4-6]。2018年9月，課題組在遼寧綏中沙河鎮(zhèn)矮砧果園進行病害調(diào)查時發(fā)現(xiàn)蘋果白絹病疑似癥狀，為了明確診斷病害和病原菌種類，進行癥狀、病情調(diào)研和采樣，同時對引起病害的病原菌進行了生物學特性研究和室內(nèi)高效藥劑篩選研究，以期為該病害的防治提供參考。1材料與方法1.1樣品采集與病原菌的分離純化2018年9月針對遼寧省綏中縣沙河鎮(zhèn)矮砧密植蘋果園開展病害調(diào)研，重點針對病株率發(fā)病特征進行調(diào)查，對病害癥狀進行詳細記錄和拍照，采集疑似白絹病典型癥狀的病株樹皮組織及根系樣本裝入塑封袋帶回實驗室。采用常規(guī)組織分離法對采集的典型標樣進行分離[7]，將樣本病健交界處組織切取為0.5mm×0.5mm大小的方塊，用75酒精表面消毒60s，再用無菌水漂洗3遍，自然風干后放置于加入0.5%乳酸的PDA平板上，每皿接3塊，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3d后，挑取菌絲尖端純化并編號，轉(zhuǎn)入試管內(nèi)4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2病原菌的致病性測定病原菌致病性測定采用菌絲塊接種法在蘋果枝條、果實和葉片上進行。采集健康長勢均一的蘋果一年生枝條、果實和葉片表面先用75%酒精消毒，再用無菌水沖洗干凈，自然風干。蘋果枝條截取為25mm后進行兩端封蠟，用直徑4mm的菌絲塊接種于枝條表面，每根枝條接3個菌塊，每處理3根枝條；果實消毒處理后，每果實接種3個菌塊，每處理3個果實；每葉片接種6個菌塊，每處理3個葉片。所有致病性試驗無傷及刺傷接種同時進行，重復2次，接種無菌PDA瓊脂塊作為對照。將接種的蘋果枝條、果實及葉片分別置于搪瓷盤及塑料盒中保濕25℃恒溫培養(yǎng)，逐日觀察并記錄發(fā)病情況。1.3病原菌鑒定1.3.1形態(tài)學鑒定將純化的分離株轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫黑暗培養(yǎng)5d，逐日觀察菌落形態(tài)特征，并在顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)及產(chǎn)孢情況。查閱相關文獻[8-10]確定病菌的分類地位。1.3.2分子生物學鑒定將供試菌株YG1和YG2在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d，收集菌絲體置于1.5mL離心管中，采用CTAB法提取分離株DNA，置于-20℃冰箱中備用。對供試菌株的對供試菌株的ITS和LSU基因進行擴增與測序，引物及退火溫度參見相關參考文獻[10]，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。50μLPCR反應體系：2×EsTaqMasterMix25μL（康為世紀CWBIO）、總DNA模板2μL、10μmol/L上下游引物各2μL、ddH2O19μL。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s（ITS）和49℃退火60s（LSU），72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結(jié)果在NCBI進行Blast同源性比對，確定菌株種類歸屬后將相關基因提交至GenBank。1.4病原菌生物學特性研究將純化的病原菌菌株YG1接種至PDA平板上，培養(yǎng)3d后采用十字交叉法測量不同碳氮源、溫度、pH值條件下的菌落直徑，分析不同條件下菌落直徑的差異[11]，每處理重復3次。碳氮源：以馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，以等摩爾質(zhì)量的木糖、半乳糖、果糖、蔗糖、山梨醇、麥芽糖和葡萄糖作為碳源，以等摩爾質(zhì)量的甘氨酸、酒石酸銨、牛肉浸膏、尿素、硝酸銨、硫酸銨和胰蛋白胨作為氮源，將菌株接種于不同碳氮源培養(yǎng)基后，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。溫度：將菌株YG1接種于PDA培養(yǎng)基上，并將其置于5、10、15、20、25、30、35和37℃條件下培養(yǎng)3d。pH值：將菌株YG1接種于pH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)3d。病原菌菌絲致死溫度試驗：將直徑4mm的菌塊移入裝有5mL無菌水的試管中，將試管分別置于40、45、50、55和60℃的恒溫水浴鍋中處理10min，然后移至PDA平板上25℃培養(yǎng)3d，每溫度處理重復3皿。產(chǎn)草酸能力測定：采用BPDA培養(yǎng)基進行病菌產(chǎn)草酸能力的半定量測定，每升PDA培養(yǎng)基中加入60mg溴酚藍[12]，即為BPDA培養(yǎng)基。菌株YG1活化后，用打孔器打取菌落邊緣菌塊，接種至BPDA培養(yǎng)基平板上，置于25℃黑暗培養(yǎng)，逐日觀察記錄培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變顏色情況，以確定菌株產(chǎn)草酸能力強弱，試驗重復3次。1.5病原菌室內(nèi)藥劑毒力測定以菌絲生長速率法測定5種殺菌劑對供試菌株的室內(nèi)毒力[13]（藥劑詳細種類及濃度見表1）。表1供試藥劑、生產(chǎn)廠家及濃度設置藥劑名稱劑型生產(chǎn)廠家濃度設置/mg·L—1400g/L氟硅唑乳油青島星牌作物科學有限公司0.05、0.1、1.0、5.0、10.015%吡唑醚菌酯懸浮劑北京燕化永樂生物科技股份有限公司0.05、0.1、1.0、5.0、10.0240g/L噻呋酰胺懸浮劑天津市漢邦植物保護劑有限責任公司0.005、0.025、0.05、0.1、1.025g/L咯菌腈懸浮種衣劑先正達作物保護有限公司0.05、0.1、0.5、1.0、5.0430g/L戊唑醇懸浮劑成都科利隆生化有限公司0.05、0.1、1.0、5.0、10.0在滅菌的PDA培養(yǎng)基冷卻至55℃左右時，加入藥劑，充分混勻，配制成系列濃度梯度的含藥平板，以加入等量無菌水的平板作為對照。用直徑4mm打孔器取病菌菌餅，接種至含藥PDA培養(yǎng)基中央，菌絲面朝下接觸培養(yǎng)基，每藥劑不同濃度處理重復4次，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照長滿90mm培養(yǎng)皿后，用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算各殺菌劑對病原菌生長的抑制率。抑制率（%）=[（對照菌落平均直徑－含藥平板菌落平均直徑）/（對照菌落平均直徑－菌餅直徑）]×100。根據(jù)抑制率求出各藥劑的毒力回歸方程、相關系數(shù)和有效抑制中濃度（EC50）。1.6統(tǒng)計分析方法試驗數(shù)據(jù)應用Excel2007和SAS9.1統(tǒng)計分析。單因素方差分析，采用Duncan新復極差法進行差異顯著性分析。長度數(shù)值以平均值±標準差表示。2結(jié)果與分析2.1病害發(fā)生情況與癥狀調(diào)查結(jié)果表明遼寧省綏中縣沙河鎮(zhèn)感病蘋果樹品種為中秋王，病株率為20%并且有逐漸發(fā)生嚴重的趨勢。感病植株樹勢衰弱，葉片失綠、萎蔫甚至落葉。根部病斑從貼近地表處開始，集中在根莖部蔓延擴展，致使皮層被環(huán)割而最終導致整樹枯死，發(fā)病部位呈黃褐色至紅褐色濕腐狀，多汁液。感病樹體皮層組織腐爛成爛泥狀，極易剝離，具有刺鼻酸味，感病木質(zhì)部組織呈紅褐色。根莖部發(fā)病部位具有明顯的白色菌絲層，病部還著生大量大小如油菜籽狀褐色至黑褐色菌核，白色菌絲層和菌核蔓延到樹體根系周圍的土壤和雜草上（見圖1-A,B）。依據(jù)發(fā)病樹體癥狀特征，初步判斷引起根腐癥狀為蘋果樹白絹病。注：A，B為病害田間癥狀;C為枝條回接發(fā)病癥狀;D為果實回接發(fā)病癥狀;E為葉片回接發(fā)病癥狀。圖1蘋果白絹病的田間癥狀與致病性測定2.2病原菌的致病性用純培養(yǎng)分離物菌絲塊接種健康蘋果枝條，恒溫保濕培養(yǎng)3d后開始顯癥（見圖1-C）。病斑呈黃色至黃褐色，沿著接種點上下擴展，呈橢圓形，接種5d后病斑長度可達15~23mm，病斑表面形成白色的菌體體，無傷與對照枝條均未發(fā)病。果實接種3d后呈現(xiàn)褐色水漬狀近圓形病斑（見圖1-D），接種5d后病斑直徑可達15~30mm，無傷對對照果實均未發(fā)病。健康葉片接種2d后即可出現(xiàn)水漬狀褐色病斑（見圖1-E），不規(guī)則形，葉片病部失水萎蔫，無傷接種同樣發(fā)病。再次針對室內(nèi)接種發(fā)病的枝條、葉片及果實的典型病斑進行分離培養(yǎng)，獲得與接種菌株形態(tài)特征一致的病原菌，完成了柯赫氏法則驗證，證明引起遼西地區(qū)蘋果根腐病的病菌為白絹病菌。2.3病原菌形態(tài)學鑒定菌株在PDA培養(yǎng)基上生長茂盛，菌絲白色羽毛狀，較纖細，菌落呈圓形輻射狀擴展，培養(yǎng)3d即可長滿直徑為90mm的培養(yǎng)皿（見圖2-A）。培養(yǎng)5~6d后形成菌核，菌核表生，集中分布或分散分布，球形或者橢圓形，初期白色，逐漸轉(zhuǎn)為淡褐色，最后變?yōu)樯詈稚ㄒ妶D2-B）。菌核表面光滑，具有光澤，內(nèi)部灰白色，直徑大小約為1.5~2.2mm。根據(jù)菌落、菌核形態(tài)特征初步判斷分離株為齊整小核菌（SclerotiumrolfsiiSacc.）圖2蘋果白絹病菌菌落形態(tài)特征2.4病原菌的分子鑒定以供試分離株YG1和YG2的DNA為模板，擴增其rDNA-ITS和LSU基因區(qū)域，經(jīng)DNA測序分析分別獲得了684bp和685bp大小的ITS基因片段，661bp大小的LSU基因片段，將相關序列提交至GenBank，登錄號為MK424481~MK424484。經(jīng)BLAST比對分析，所獲序列與GenBank中的齊整小核菌SclerotiumrolfsiiSacc.相關菌株相似性均達99%~100%。結(jié)合病原菌形態(tài)特征及DNA序列比對分析，將分離株YG1、YG2鑒定為齊整小核菌SclerotiumrolfsiiSacc.。2.5病原菌的生物學特性2.5.1不同碳氮源的影響碳氮源試驗結(jié)果表明，病原菌在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長最好，培養(yǎng)3d菌落直徑可達90.0mm；生長較差的碳源是木糖，培養(yǎng)3d菌落直徑僅為12.0mm。病原菌在胰蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上生長最好，培養(yǎng)3d菌落直徑可達26.5mm，在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上無法生長（表2）。表2不同碳氮源對蘋果白絹病菌菌落生長的影響不同碳源菌落直徑/mm不同氮源菌落直徑/mm葡萄糖90.0±0.0A胰蛋白胨26.5±5.8A蔗糖28.3±3.9B酒石酸銨23.8±1.8AB山梨醇26.8±8.0B硫酸銨23.2±7.3AB麥芽糖23.0±6.4BC酵母浸膏23.0±2.7AB果糖18.8±1.5CD硝酸銨22.5±2.3AB半乳糖17.5±3.9D甘氨酸21.0±4.5B木糖12.0±2.8E尿素4.0±0.0C注：不同大寫字母表示差異顯著（p＜0.05）2.5.2溫度和pH值對病原菌生長影響病原菌在5℃條件下僅可微弱生長，在10~35℃均可正常生長，25~30℃時病菌生長最快，3d之日均可長滿90mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)溫度為37℃時病菌幾乎無法生長。病原菌在pH值范圍為3~12時均可生長，當pH值為3~9時，病原菌生長最快，培養(yǎng)3d即可長至90mm，當pH值為10時，病原菌隨著pH值增加生長逐漸變慢（表3）。表3不同溫度和pH值對蘋果白絹病菌菌落生長的影響溫度/℃菌落直徑/mmpH值菌落直徑/mm57.8±0.7E390±0.0A1019.3±1.0D490±0.0A1558.0±2.0B590±0.0A2088.8±2.3A690±0.0A2590.0±0.0A790±0.0A3090.0±0.0A890±0.0A3550.0±4.1C990±0.0A378.0±0.0E1081.3±1.0B1161.8±2.9C1222.3±2.1D注：不同大寫字母表示差異顯著（p＜0.05）2.5.3病原菌致死溫度及產(chǎn)草酸能力經(jīng)50℃水浴處理后的菌絲塊無法在PDA培養(yǎng)基上生長，由此明確該菌菌絲致死溫度為50℃。供試菌株在溴酚藍指示培養(yǎng)基（BPDA）平板上黑暗培養(yǎng)2d后開始轉(zhuǎn)色，3d后最終使培養(yǎng)基由藍色轉(zhuǎn)變成為黃色，由此確定病原菌具有產(chǎn)草酸能力。2.6幾種殺菌劑對病菌的室內(nèi)毒力選擇生產(chǎn)上常見的5種殺菌劑進行了蘋果白絹病菌菌絲生長抑制比較研究，結(jié)果表明，供試5種藥劑對病原菌均有抑制作用，各殺菌劑毒力回歸方程的相關系數(shù)均接近于1，可信度較高，由其推算的EC50值也比較準確。噻呋酰胺對蘋果白絹病菌菌絲生長抑制作用最強，EC50為0.0565，戊唑醇對病原菌菌絲生長抑制作用最差，EC50為0.7564，吡唑醚菌酯、咯菌腈和氟硅唑?qū)z生長抑制效果居中，EC50大小從0.2675至0.5965（見表4）。表4不同殺菌劑對蘋果白絹病菌菌絲生長的毒力藥劑回歸方程相關系數(shù)EC50/mg·L—1400g/L氟硅唑y=5.2279x+1.01600.96880.596515%吡唑醚菌酯y=5.5322x+0.92930.97250.2675240g/L噻呋酰胺y=6.4452x+1.15790.98800.056525g/L咯菌腈y=5.8319x+1.64300.97940.3117430g/L戊唑醇y=5.1036x+0.85450.98930.75643討論我國是世界上蘋果栽培面積最大的國家，長期以來關于蘋果病害的研究報道主要集中于傳統(tǒng)三大病害——蘋果樹腐爛病、輪紋病和早期落葉病[2-3]，而關于蘋果白絹病鮮有相關研究報道。引起蘋果白絹病的病原菌齊整小核菌SclerotiumrolfsiiSacc.具有廣泛的寄主范圍，為害麥類、谷子、花生、大豆、棉花、麻類、薯類、煙草、蔬菜、瓜類和果樹等60多科，210多種植物[4,12]。引起植物癥狀主要有猝倒、莖基腐爛、果實腐爛和根際腐爛等，白絹病發(fā)生嚴重植株葉片變黃、病株枯死，菌核在土壤中可存活4—5年。準確的病原診斷鑒定，病菌的生物學特性與致病性是研究病害發(fā)生規(guī)律和防治措施的重要基礎[14]。本研究針對遼寧綏中中秋王蘋果種植園開展白絹病診斷及防治基礎研究，采用菌物形態(tài)結(jié)合分子學手段明確了病原歸屬，首次證實了白絹病菌可以侵染蘋果的根、果實以及葉片；研究結(jié)果表明病菌在10~35℃的溫度范圍內(nèi)可正常生長，25~30℃時病菌生長最快，這與白絹病在遼寧西部地區(qū)多在8~9月份夏季高溫潮濕天氣發(fā)生有很大關系，這與高常燕等的報道相似[4]，病原菌隨著pH值增加生長逐漸變慢，說明病害的發(fā)生喜好酸性的土壤環(huán)境，所以在防治該病時可有針對性的調(diào)整土壤的酸堿性；在營養(yǎng)生長試驗中病菌可以較好的利用葡萄糖，而無法利用尿素，這與病害在果實座果期間加重危害有關。草酸是一些病原真菌的致病因子[15]，本研究所采用菌株具有較強的產(chǎn)草酸能力。本研究病原菌室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明：所選用的5種藥劑戊唑醇、吡唑醚菌酯、噻呋酰胺、咯菌腈和氟硅唑均對白絹病菌有抑制作用，其中噻呋酰胺可作為首選用藥，在生產(chǎn)季節(jié)與其他藥劑交替使用，進行輪換用藥。李棟等[5]的室內(nèi)毒力測定結(jié)果研究表明吡唑醚菌酯、咯菌腈和甲基立枯磷三種藥劑抑菌效果較好，可作為防治蘋果白絹病的主推藥劑。本研究結(jié)果拓寬了病害防治過程中藥劑種類的選擇范圍，為及時有效地防治病害奠定了理論基礎。白絹病致病菌齊整小核菌屬于土壤習居菌，以菌絲或菌核在土壤中或病根上越冬，病菌在土壤中隨著灌溉水流動傳播[6]。根據(jù)我們調(diào)查分析，遼西地區(qū)一些蘋果園澆水方式多采用澆灌方式，可能是造成病害流行的因素之一，另外，有些蘋果園中果樹與花生的間作可能是導致病原菌寄主間轉(zhuǎn)移傳播的重要原因。綜合分析，果園土壤酸性、重茬、土壤中病原基數(shù)較大、長期積水透氣性差均是導致病害發(fā)生嚴重的因子，因此，改良土壤結(jié)構(gòu)及酸化土壤，及時排水，合理的修剪，早春針對病樹進行扒土晾根，刮除病斑涂藥處理，綜合利用以上策略進行蘋果白絹病的科學防治。參考文獻[1]陳紅，王倩，高強.我國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展及其影響因素分析——基于7個主產(chǎn)省份的面板數(shù)據(jù)[J].中國果樹，2019（1）：92-95[2]徐成楠，岳強，冀志蕊，等.2015年遼寧省蘋果園農(nóng)藥使用情況調(diào)查與分析[J].中國果樹，2017（2）：80-83[3]王樹桐，王亞南，曹克強.近年我國重要蘋果病害發(fā)生概況及研究進展[J].植物保護，2018,44（5）：13-25[4]高常燕，李保華.蘋果白絹病的發(fā)病流行條件與防治方法[J].中國植物病理學會2017年學術(shù)年會論文集，2017，456[5]李棟，董向麗，李平亮，等.8種殺菌劑對蘋果樹白絹病菌的室內(nèi)毒力測定[J].中國植物病理學會2017年學術(shù)年會論文集，2017，457[6]劉美英，宋來慶，趙玲玲，等.蘋果白絹病的發(fā)生與防治[J].煙臺果樹，2018（4）：35[7]方中達.