細(xì)胞傳代和H·E染色盧文

傳代細(xì)胞培養(yǎng)以及染色生31盧文2003012377【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆占?xì)胞傳代培養(yǎng)的原理和方法；掌握傳代細(xì)胞染色的方法。【實(shí)驗(yàn)試劑和材料】實(shí)驗(yàn)用試劑PBS緩沖液（無Ca2+、Mg2+）：pH為7.2至7.4。培養(yǎng)液：DMEM+10%NBS（血清）+1%雙抗（100×，即10000U/mL的青霉素與鏈霉素混合劑）。pH約7.2。消化液：0.25%胰蛋白酶（trypsin）+1mmol-1EDTA混合液。Carnoy固定液（冰醋酸:無水乙醇＝1:3），蘇木精染液（蘇木精0.5g，無水乙醇10mL，硫酸鋁鉀25g，蒸餾水150mL，完全溶解后，混合均勻，加熱煮沸3－5min，加入蒸餾水至500mL，最后加入0.1g碘酸鈉），伊紅染液（0.5g伊紅B、100mL80%乙醇），0.5%鹽酸酒精溶液（0.5mL鹽酸、100mL70%乙醇），0.5%氨水。實(shí)驗(yàn)材料小平皿、自動取液器、酒精燈、火柴?！緦?shí)驗(yàn)步驟】傳代培養(yǎng)（全部步驟均在超凈工作臺操作）步驟：鏡檢，觀察并記錄細(xì)胞狀態(tài)。吸棄培養(yǎng)基，加入1mLPBS溶液洗去殘余培養(yǎng)基。加200uL胰酶－EDTA溶液，37oC消化1－2min。加800uL含10％血清的DMEM培養(yǎng)基（終止消化、懸浮細(xì)胞）。按比例分盤，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。每盤細(xì)胞密度一致，細(xì)胞分散均勻。37oC、5％CO2培養(yǎng)。細(xì)胞染色（在實(shí)驗(yàn)臺進(jìn)行）步驟：顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)（4×10倍），繪圖。吸棄舊的培養(yǎng)液，用PBS蕩洗一次。用Carnoy固定液固定3min。吸棄固定液，用蒸餾水蕩洗一次。鐵礬蘇木精染色10min。用流動的自來水洗滌一次，加入0.5%的鹽酸酒精溶液分色（數(shù)秒），再用流動的自來水水洗一次。加入0.5%的氨水返藍(lán)（作用于蘇木精染劑），立即棄去。用流動的自來水洗一次，觀察細(xì)胞染色效果。如效果較好加入伊紅溶液染色，加入數(shù)秒后立即棄去。用蒸餾水洗滌次。鏡檢，繪出細(xì)胞形態(tài)圖并照相。細(xì)胞生長期觀察（在緩沖間進(jìn)行）步驟：細(xì)胞培養(yǎng)的1天后，從培養(yǎng)箱取出平皿，顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)目、密度和形態(tài)情況?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】觀察到的細(xì)胞貼壁和染色后圖像見手繪圖及圖1。蘇木精-伊紅染色之后，細(xì)胞核呈紫色，細(xì)胞質(zhì)呈淡粉紅色。圖1：染色結(jié)果在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，開始培養(yǎng)的一天后觀察可見細(xì)胞已經(jīng)開始增殖，鏡下可見三至五個細(xì)胞團(tuán)簇貼壁生長的景象?！緦?shí)驗(yàn)小結(jié)與討論】傳代細(xì)胞的特點(diǎn)：傳代細(xì)胞是指來自人或動物的腫瘤組織或者正常組織的細(xì)胞，其染色體組型發(fā)展為非整倍體或二倍體低于75%。這種非整倍體細(xì)胞在體外具有無限傳代的生命力。通常具有異種移植的能力和較廣泛的病毒敏感性。傳代細(xì)胞的特點(diǎn)是：具有恒定繁殖特性，少數(shù)細(xì)胞及有繁殖能力，在瓊脂內(nèi)能形成克?。蝗旧w組型為異倍體，大多數(shù)人源細(xì)胞染色體為60-70條左右；保留種屬特異性，但組織分化性和臟器特性均消失；具有致癌性。由于傳代細(xì)胞繁殖迅速，易獲得，易保存，為各種實(shí)驗(yàn)所廣泛采用。影響HE染色效果的因素：因?yàn)镠E染色是依靠靜電吸附原理進(jìn)行染色，其影響因素如下：固定因素：固定劑對組織有一定媒染效果，它一方面可與蛋白質(zhì)相結(jié)合，同時可能與燃料相結(jié)合，故能增強(qiáng)著色能力；同時固定劑能沉淀和凝固蛋白質(zhì)、脂肪、糖等細(xì)胞內(nèi)成分，而這種沉淀及凝固關(guān)系能使細(xì)胞內(nèi)成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學(xué)上的差異，使得生活情況下原來看不清的結(jié)構(gòu)變得清晰起來。所以，組織固定不良師造成染色不均、灰染的主要原因。在HE染色中，固定不足或過度都容易使片子發(fā)灰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰。固定后的水洗：在本次實(shí)驗(yàn)中我們采用的固定劑是卡諾固定劑即冰醋酸和無水乙醇的混合液，因此在固定后必須充分水洗去固定液，否則殘留的冰醋酸時標(biāo)本成酸性，將嚴(yán)重影響蘇木精對細(xì)胞核的染色。蘇木精的染色時間：據(jù)我的看法，以5min左右為宜。分色要適度：這是一個重要環(huán)節(jié)，若切片分化不足，細(xì)胞著色過深，使核質(zhì)的分界不清楚，核不清晰；若分色過度，核太淡，反差不好。用0.5%的鹽酸酒精分色，我晃晃培養(yǎng)皿就迅速倒出。效果還好，稍微有點(diǎn)偏紅。反藍(lán)和伊紅染色：這兩步時間都不可太長。一般都是搖晃一下培養(yǎng)皿，使溶液和細(xì)胞充分接觸后就迅速倒出。關(guān)于蘇木精和伊紅的染色原理和實(shí)驗(yàn)時使用的方法。伊紅B（eosinB）可以通過復(fù)染色與胞質(zhì)的膠原蛋白作用從而使細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)顏色。蘇木精可以對細(xì)胞核特異性染色（Fulmer和Lillie法中主要是對細(xì)胞核蛋白染色）。蘇木精配方中的碘酸鈉主要起到使染劑盡快成熟的作用。由于伊紅的染色原理為復(fù)染，實(shí)驗(yàn)中必須在用蘇木精染過一次才可進(jìn)行。然而如果伊紅染色過深，其紅色會完全覆蓋掉之前用蘇木精染過的細(xì)胞核的藍(lán)色。因此可以在伊紅染過一次后再用蘇木精染一次，可以得到良好的效果。關(guān)于無菌操作的一些要點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)是本學(xué)期細(xì)胞生物學(xué)的最后一次實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)中我學(xué)習(xí)了日后會經(jīng)常使用的無菌操作的基本要點(diǎn)。由于它和“有菌操作”有著很大的不同，我總結(jié)了實(shí)驗(yàn)中需要注意的幾個要點(diǎn)如下：無菌操作所用的器材和樣品一定不能暴露于超凈工作臺之外