大學(xué)試題(醫(yī)學(xué))-現(xiàn)代生化藥學(xué)筆試（2018-2023年）真題摘選含答案

長風(fēng)破浪會有時，直掛云帆濟(jì)滄海。大學(xué)試題(醫(yī)學(xué))-現(xiàn)代生化藥學(xué)筆試（2018-2023年）真題摘選含答案（圖片大小可自由調(diào)整）卷I一.參考題庫(共30題)1.PCR是（）發(fā)明的。2.液體閃爍計數(shù)器和晶體閃爍計數(shù)器分別適合檢測什么樣的放射性線？3.核酸分子雜交的分子基礎(chǔ)是什么？4.使用核酸雜交方法篩選cDNA文庫時使用的探針有哪幾種？5.簡述巢式PCR。6.PCR反應(yīng)中對于加入的dNTP有什么要求？7.預(yù)雜交的作用是什么？8.酵母雙雜交體系常常出現(xiàn)假的陽性結(jié)果，應(yīng)該如何正確判讀得到的結(jié)論呢？9.簡述降落PCR。10.酵母雙雜交系統(tǒng)（兩個Pr相互作用）的原理是什么？一般由哪幾部分組成？11.為什么PCR中對產(chǎn)物進(jìn)行終點檢定量不準(zhǔn)確？12.核酸的非放射性標(biāo)記技術(shù)可以分哪幾類？13.提高PCR反應(yīng)的特異性一般可以使用哪幾種方法？14.什么是熱啟動？15.Souther雜交的過程一般分為哪幾步驟？16.PCR的英文全稱是（）17.RT的基本原理是什么？18.PCR反應(yīng)對模板有什么要求？19.舉例說明同位素示蹤法在分子生物學(xué)核生物化學(xué)中的應(yīng)用。20.放射性的“三廢”是指哪三廢？21.DNA快速末端標(biāo)記中使用的酶是什么酶？使用的常用同位素是什么？22.放射性測量的原理是什么？探測儀可以分為哪2類？23.PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中一般會生成幾種長度不同的產(chǎn)物？24.缺口平移標(biāo)記技術(shù)的原理是什么？利用了什么酶的哪些？25.同位素示蹤法中使用的同位素是哪種同位素？26.核酸探針的種類有哪些？各有什么特點？27.醫(yī)院中使用的X光機(jī)中有沒有輻射源？為什么？28.什么是定量PCR的Ct值？Ct值是如何確定的？29.閃爍計數(shù)器的工作原理是什么？30.外照射的α，β和伽馬射線應(yīng)該分別如何防護(hù)？卷I參考答案一.參考題庫1.參考答案:KaryMullis2.參考答案:液體閃爍計數(shù)器適合檢測α-ray和低能β-ray；晶體閃爍計數(shù)器適合γ-ray。3.參考答案: 核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵（主要是氫鍵）的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，這就是核酸分子雜交的基礎(chǔ)。不要求兩條單鏈堿基順序完全互補(bǔ)。RNA-RNA，DNA-DNA，DNA-RNA。4.參考答案:1.同源探針（差異顯示技術(shù)，EST數(shù)據(jù)庫）2.簡并性寡核苷酸探針3.cDNA探針5.參考答案:由兩輪PCR和兩套引物組成。首先對靶DNA進(jìn)行第一步擴(kuò)增，然后從第一次反應(yīng)產(chǎn)物中取出少量作為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增，第二次PCR引物與第一步反應(yīng)產(chǎn)物序列互補(bǔ)，第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即為目的產(chǎn)物。提高特異性和靈敏性。外側(cè)引物25bp，退火溫度高(68℃)；內(nèi)側(cè)引物17bp，退火溫度低(46℃)。6.參考答案: 1.dNTP應(yīng)具有一定濃度：50-200μmol/L，不得低于10-15。濃度過高會抑制Taq酶活性，較低濃度可降低錯誤摻入；高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯誤摻入，而濃度過低會導(dǎo)致產(chǎn)量過低； 2.標(biāo)準(zhǔn)PCR中包含四種等摩爾濃度的脫氧核苷三磷酸，否則會誘導(dǎo)聚合酶錯誤摻入而降低產(chǎn)率、提前終止反應(yīng)； 3.不能反復(fù)凍融，否則會降解。7.參考答案: A.防止非特異性雜交 B.封閉試劑8.參考答案: 1.用不同的報道基因系統(tǒng)的雙雜交實驗來重復(fù)篩選 2.通過在體外檢測誘餌蛋白與獵物蛋白在體外的相互作用情況，如免疫共沉淀 3.基于生物學(xué)知識判斷兩蛋白是否會在生物細(xì)胞中發(fā)生相互作用 4.查詢前人是使用酵母雙雜交系統(tǒng)時總結(jié)的經(jīng)驗9.參考答案:降落PCR是Don于1991年最早發(fā)明的，退火溫度起始于高于Tm值計算15度，之后每過一個循環(huán)溫度降低1℃(或n℃)，直到達(dá)到一個較低的退火溫度(Tm值以下5℃)，這個溫度為“touchdown”退火溫度。由于正確和非正確的退火溫度造成的產(chǎn)量是指數(shù)級的，因此可以使正確產(chǎn)物得到累計。當(dāng)溫度降低到非特異性退火溫度時，就會發(fā)生非特異性結(jié)合，但此時的特異性結(jié)合產(chǎn)物已經(jīng)累計了一個幾何級數(shù)的優(yōu)勢，因此非特異性結(jié)合產(chǎn)物的量不會很多。10.參考答案: 原理：在這一系統(tǒng)中，與誘餌蛋白融合的DNA-BD（DNA結(jié)合域）和與文庫獵物蛋白融合的AD（轉(zhuǎn)錄激活域）均來自GAL4相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域.將誘餌蛋白與獵物蛋白的編碼質(zhì)粒分別導(dǎo)入同一個GAL4缺失的酵母細(xì)胞中，通過兩種相互作用蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，可以重建GAL4的活性，轉(zhuǎn)錄激活相應(yīng)的效應(yīng)基因。 三個基本組成部分： 1.編碼靶蛋白與DNA結(jié)合域融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒.這種靶蛋白在雙雜交系統(tǒng)中專稱誘餌蛋白； 2.cDNA質(zhì)粒表達(dá)文庫，文庫cDNA表達(dá)出的蛋白與轉(zhuǎn)錄激活域形成融合蛋白，這些蛋白統(tǒng)稱為獵物蛋白； 3.能反映出體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子活性重建的宿主酵母菌及體現(xiàn)出這種活性的報道基因系統(tǒng)。11.參考答案:隨著PCR的進(jìn)行，反應(yīng)體系中的引物、dNTP，甚至模板都會供不應(yīng)求，導(dǎo)致PCR的效率下降，產(chǎn)物增長速度越來越慢。直到Taq酶都被飽和后，反應(yīng)就進(jìn)入平臺期。在實際實驗中，由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互影響，每個反應(yīng)進(jìn)入平臺期的時間及平臺期的高低都不同，導(dǎo)致終產(chǎn)物濃度各不相同。即使是重復(fù)實驗，也不可能做到同時進(jìn)入平臺期。因此反應(yīng)終產(chǎn)物與原始拷貝數(shù)無線性關(guān)系，定量不準(zhǔn)確。12.參考答案: 酶促反應(yīng)標(biāo)記法（缺口平移，隨機(jī)引物，末端加尾.敏感度高，產(chǎn)量低，成本高） 化學(xué)修飾標(biāo)記法（將標(biāo)記物用化學(xué)反應(yīng)連于DNA分子，成本低，用于大量制備）13.參考答案: A.引物設(shè)計：引物長度、堿基配對是否嚴(yán)格、GC%含量、退火溫度、引物濃度與純度、穩(wěn)定性、是否為簡并性引物等； B.使用熱啟動：在變性完成之后再加入DNA聚合酶（或聚合酶才有活性），這樣可以提高特異性，因為DNA聚合酶在低溫時也有活性，可能引起非特異的擴(kuò)增； C.鎂離子濃度：不同的模板和引物有不同的鎂離子濃度，應(yīng)進(jìn)行預(yù)實驗進(jìn)行探索；較高的鎂離子濃度會提高產(chǎn)量，同時降低特異性；dNTP濃度較高時應(yīng)適當(dāng)提高鎂離子濃度； D.促進(jìn)PCR的添加劑：降低DNA熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)，可提高特異性和產(chǎn)率； E.使用巢式PCR：降低擴(kuò)增多個靶位點的可能性，提高特異性。14.參考答案:在模板DNA完全變性后再加入DNA聚合酶（或使DNA聚合酶有活性）的方法，可減少低溫下DNA聚合酶活性造成的非特異性擴(kuò)增。15.參考答案:①DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化→②瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段→③DNA堿變性，Tris緩沖液中和→④高鹽下通過毛吸作用將DNA轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素濾膜上，烘干固定（在凝膠中的相對位置在轉(zhuǎn)移到膜的過程中仍保持著）→⑤附于膜上的DNA與P32標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶動位置。16.參考答案:PolymeraseChainReaction17.參考答案:在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，即以oligo（dT）、隨機(jī)六聚寡核苷酸或基因特異序列為引物，與mRNA結(jié)合之后，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下延伸合成cDNA第一鏈，再以其為模板PCR。18.參考答案:基因組DNA、噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA、cDNA、mRNA、預(yù)先擴(kuò)增的DNA均可作為模板。PCR反應(yīng)對模板純度要求不是很高，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法制備的樣品即可以作為模板；但是模板中絕對不能含有蛋白酶、核酸酶、Taq酶抑制劑和任何可以結(jié)合DNA的蛋白；雖然片段長短不是影響PCR效率的關(guān)鍵因素，短片段模板PCR效率更高；為保證反應(yīng)的特異性，應(yīng)使用ng級的克隆DNA、μg級的單拷貝染色體DNA、或104拷貝的待擴(kuò)增片段。19.參考答案:物質(zhì)代謝的研究、物質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究、動態(tài)平衡的研究、生物樣品中微量物質(zhì)的分析、最近鄰序列分析法?物質(zhì)代謝的研究：體內(nèi)存在著很多種物質(zhì)，究竟它們之間是如何轉(zhuǎn)變的，如果在研究中應(yīng)用適當(dāng)?shù)耐凰貥?biāo)記物作示蹤劑分析這些物質(zhì)中同位素含量的變化，就可以知道它們之間相互轉(zhuǎn)變的關(guān)系，還能分辯出誰是前身物，誰是產(chǎn)物，分析同位素示蹤劑存在于物質(zhì)分子的哪些原子上，可以進(jìn)一步推斷各種物質(zhì)之間的轉(zhuǎn)變機(jī)制。20.參考答案:放射性廢氣、廢液、固廢。21.參考答案: DNA快速末端標(biāo)記中使用的酶： a.Klenow片段（用于5’延伸端，大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶切割得到，有5’-3’聚合酶活性；3’-5’外切酶活性）； b.T4DNA聚合酶（用于3’延伸端）。 DNA快速末端標(biāo)記中使用的同位素：[α-32P]dNTP。22.參考答案:放射性同位素發(fā)出的射線與物質(zhì)相互作用，會直接或間接產(chǎn)生電力和激發(fā)等效應(yīng)，以此探測放射性的存在、強(qiáng)度和放射性同位素的性質(zhì)。分為徑跡型和信號型。23.參考答案: PCR反應(yīng)中一般會產(chǎn)生2種不同長度的產(chǎn)物：一種是預(yù)期長度的產(chǎn)物，一種是比預(yù)期長度長得多的產(chǎn)物；前者以指數(shù)級數(shù)增加（2的n次方），后者以幾何級數(shù)增加（2n）。因此后者在總產(chǎn)物中所占比重很小，可忽略不計。24.參考答案: 原理：首先用DNA酶在雙鏈DNA探針分子的一條鏈上制造一些缺口，缺口處會形成3’-羥基末端，這時再在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的催化下將核苷酸殘基加在3’-OH上，同時根據(jù)該酶的5’→3’核酸外切酶活性，此酶將缺口5’側(cè)核苷酸依次切除。其結(jié)果是在缺口平移。若用高強(qiáng)度的放射性核苷酸（[α-32P]dATP），即得到被標(biāo)記的DNA探針。 酶：DNA聚合酶Ⅰ的核酸外切酶活性，核酸外切酶水解核苷酸的活性。25.參考答案:在不同的實驗中、不同的實驗要求下選用的同位素不同。一般情形是根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯嶒炛芷陂L短，來選擇具有合適的衰變方式，輻射類型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。26.參考答案: A.基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類。 B.根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針及寡核苷酸探針等幾類。 C.DNA探針還有單鏈和雙鏈之分 各自特點： DNA探針：最常用的核酸探針；主要特點有： 1.這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。 2.DNA探針不易降解。一般可有效抑制DNA酶活性。 3.DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇。（多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列，須是特異的） cDNA探針：互補(bǔ)于mRNA的DNA分子（一般都為編碼序列）。cDNA是由RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生的不含有內(nèi)含子序列，尤其適合于基本表達(dá)的檢測。 RNA探針：主要用于研究目的，而不是用于檢測。高雜交效率，但也易降解、標(biāo)記方法復(fù)雜（標(biāo)記效率低）。 寡核酸探針： 1.鏈短、序列復(fù)雜度低、分子量小，所以和等量靶位點完全雜交的時間比克隆探針短。 2.寡核苷酸探針可識別靶序列內(nèi)1個堿基對變化。 3.一次可大量合成寡核苷酸探針，價格低廉，可用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。27.參考答案: 沒有。 高速電子轟擊靶物質(zhì)時，會產(chǎn)生X射線。X光機(jī)的核心部分是X線管，通常由安裝在真空玻璃殼內(nèi)的陰極和陽極組成。陰極為鎢絲，陽極則根據(jù)不同需要由不同材料制成多種形狀。也就是說，X光機(jī)里沒有“密封源”。28.參考答案: Cycle?threshold（Ct）：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即在PCR中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長的拐點處所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。 Ct值的含義是：PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。 確定：PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省沒置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。實驗操作中，Ct值定義為極限上方產(chǎn)生可檢測到的統(tǒng)計學(xué)上顯著的熒光發(fā)射所對應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)?！盎€上方”也就是閾值高度的量化，定義是基線范圍內(nèi)熒光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。閾值所在的橫線與PCR擴(kuò)增曲線的交點所指的PCR循環(huán)次數(shù)就是Ct值。Ct值越小，模板DNA的起始拷貝數(shù)越多；Ct值越大，反之。正常：18～30。Ct值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于試驗質(zhì)量。29.參考答案:閃爍型探測器由閃爍體-光電倍增管-放大器-分析器-定標(biāo)器組成。閃爍體吸收射線后發(fā)出光信號，被光電倍增管收到而發(fā)生光電效應(yīng)，轉(zhuǎn)化成電信號并逐級放大，最后被定標(biāo)器記錄下來。放射性同位素越多，發(fā)出的光信號越多，電信號也越多。30.參考答案:α粒子穿透能力弱，不會引起外照射損傷，紙可阻擋；β輻射常采用低原子序列的鋁或有機(jī)玻璃；X、γ射線常采用高原子序列的鉛、鐵或經(jīng)濟(jì)適用的混凝土等材料。卷II一.參考題庫(共30題)1.簡述競爭性PCR。2.什么叫放射源？3.常用的促進(jìn)PCR特異性的試劑有哪些？4.舉例說明哪些生物反應(yīng)是屬于探針一靶反應(yīng)？5.什么叫定量PCR？6.什么叫外照射？內(nèi)照射？輻射的確定性效應(yīng)？隨機(jī)效應(yīng)？7.放射防護(hù)的3原則是什么？8.酵母單雜交系統(tǒng)（Pr與DNA相互作用）的原理和主要功能是什么？9.簡述Taqman探針技術(shù)的原理。10.噬菌體表面展示技術(shù)的原理是什么？11.簡述多重PCR。12.什么叫同位素效應(yīng)？13.簡述簡并PCR。14.對表達(dá)文庫（基因編碼Pr特異性）進(jìn)行高通量的功能性篩選有哪幾種方法？15.簡述不對稱PCR。16.什么叫閃爍體？17.RNA的提取18.PCR的基本原理是什么？19.什么叫PCR的反應(yīng)平臺？形成的原因可能是什么？20.核酸探針常用的酶促標(biāo)記技術(shù)有哪幾種？21.什么叫半衰期？22.PCR反應(yīng)一般分為幾個步驟？各步驟有什么特點？23.核酸分子雜交實驗的優(yōu)化一般可以從哪幾個方面考慮？24.什么叫文庫的庫容量？有什么意義？25.如何考察確定一個cDNA文庫的質(zhì)量？26.PCR中使用的DNA聚合酶有哪幾種，各具有哪些特點？27.什么叫細(xì)胞的間期死亡？增殖死亡？28.常用來構(gòu)建文庫使用的載體系統(tǒng)有哪些？各有什么特點？29.解釋RT-PCR的基本原理。30.什么叫“核衰變”？卷II參考答案一.參考題庫1.參考答案:首先將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后在擴(kuò)增體系中加入濃度已知的競爭性參考模板，這兩種模板都可以與引物競爭性結(jié)合，但產(chǎn)物可因大小不同或酶切位點不同而區(qū)分開。之后在凝膠電泳上測定兩種產(chǎn)物的濃度后即可推斷mRNA的初始濃度。2.參考答案:用放射性物質(zhì)制成的，能產(chǎn)生輻射照射的物體。3.參考答案:甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿，PCRx?Enhancer?Solution。4.參考答案: A.抗原-抗體 B.外源凝集素-碳水化合物 C.親和素-生物素 D.受體-配基 E.互補(bǔ)核酸間的雜交5.參考答案:利用PCR反應(yīng)來測定樣品中的DNA或RNA的原始拷貝數(shù)量。利用每個循環(huán)都能同步偵測到PCR產(chǎn)物的增生，以獲得達(dá)到反應(yīng)飽和前的資料。6.參考答案: 外照射：輻射源由體外照射人體。生物效應(yīng)強(qiáng)。如γ-ray、中子、X-ray。 內(nèi)照射：放射性物質(zhì)通過某種途徑進(jìn)入人體，以其輻射能產(chǎn)生生物效應(yīng)者為內(nèi)照射。如αβray。 輻射的確定性效應(yīng)：輻射的嚴(yán)重程度與照射劑量的大小有關(guān)，效應(yīng)的嚴(yán)重程度取決于細(xì)胞群中受損細(xì)胞的數(shù)量或百分率。如白細(xì)胞減少、皮膚紅斑脫毛、白內(nèi)障。 隨機(jī)效應(yīng)：效應(yīng)的發(fā)生率與照射劑量的大小有關(guān)，這種效應(yīng)在個別細(xì)胞損傷時即可出現(xiàn)，無閾劑量。如誘發(fā)癌癥和遺傳效應(yīng)。7.參考答案:放射實踐正當(dāng)化；放射防護(hù)最優(yōu)化；個人劑量限制。8.參考答案: 原理：與雙雜交系統(tǒng)一樣，也是利用了真核轉(zhuǎn)錄因子的DNA-BD和AD兩個功能結(jié)構(gòu)域的可分離性。（文庫cDNA與轉(zhuǎn)錄因子AD區(qū)融合；誘餌不是某已知Pr而是任一短的雙鏈DNA）。 功能：是cDNA文庫篩選的另一種方法，主要用于從cDNA文庫中篩選出與特定DNA序列結(jié)合的蛋白基因，如轉(zhuǎn)錄因子等基因表達(dá)調(diào)控因子，是目前分離這些蛋白基因最有效和可靠的方法。9.參考答案: Taqman探針法是高度特異性的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的5’→3’外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號，由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性的結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5’端標(biāo)記有報告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)探針完整的時候，報告基因所發(fā)出的熒光能量被淬滅集團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5’→3’外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程。信號強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。 根據(jù)其3，端標(biāo)記的熒光猝滅基團(tuán)的不同分為：普通的Taqman探針和TaqmanMGB探針。10.參考答案: 利用大腸桿菌絲狀單鏈DNA噬菌體（fd或M13）作為載體，在重組噬菌體顆粒表面展示外源多肽分子.外源蛋白在噬菌體表面上展現(xiàn)，是通過外源蛋白在宿主大腸桿菌分泌性表達(dá)過程中與絲狀噬菌體外膜結(jié)構(gòu)蛋白（如主要外膜蛋白P8和次要外膜蛋白P3）形成牢靠的復(fù)合物而得以實現(xiàn)。 方法一：通過基因重組操作，構(gòu)建外源基因與噬菌體外膜蛋白基因的融合基因，直接產(chǎn)生出外源蛋白與外膜結(jié)構(gòu)蛋白的嵌合分子.外源Pr?C端與P3/P8?N端；外源N端與P6C端。 方法二：在表達(dá)基因的構(gòu)件上，分別使表達(dá)出的噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白P3或P8的N端和外源蛋白的C端分別融合上一種短的介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的功能結(jié)構(gòu)域。如亮氨酸拉鏈。11.參考答案:用于檢測多個基因的表達(dá)，且這些基因都與某一疾病的檢測、治療或預(yù)后有關(guān)。其原理與常規(guī)RT-PCR相似，分為反轉(zhuǎn)錄和PCR兩部分，不同點在于：在反轉(zhuǎn)錄過程，前者使用Oligo（dT）或隨機(jī)六聚寡核苷酸為引物，而不用基因特異性引物；在PCR過程，前者需要設(shè)計多對引物，以擴(kuò)增多個基因表達(dá)產(chǎn)物。12.參考答案:指放射性同位素（或是穩(wěn)定性同位素）與相應(yīng)的普通元素之間存在著化學(xué)性質(zhì)上的微小差異所引起的個別性質(zhì)上的明顯區(qū)別，對于輕元素而言，同位素效應(yīng)比較嚴(yán)重。13.參考答案:一般PCR根據(jù)確定的核苷酸序列設(shè)計引物，簡并PCR一般用于已知氨基酸序列而不知道核苷酸序列的情況。根據(jù)氨基酸密碼子的簡并性，設(shè)計兩組帶有一定簡并性的引物庫，以擴(kuò)增出未知核苷酸序列的基因。這些引物有很多相同堿基，但也有堿基不同，這樣保證了和多種同源序列發(fā)生退火。14.參考答案: 1.噬菌體表面展示系統(tǒng) 2.酵母雙雜交系統(tǒng) 3.酵母單雜交系統(tǒng)15.參考答案: 不對稱PCR的基本原理是采用不等量的一對引物產(chǎn)生大量的單鏈DNA。 分為引物濃度不對稱PCR和熱不對稱PCR。結(jié)果是產(chǎn)生大量的單鏈DNA，又避免了在檢測時要先出去剩余引物的操作。 引物濃度不對稱PCR：兩引物的濃度不同，其中濃度低的為限制性引物，起決定性作用，只有當(dāng)限制性引物耗盡后才會開始大量產(chǎn)生ssDNA；濃度高的為非限制性引物。前10-15循環(huán)為雙鏈產(chǎn)物，而后為單鏈。?常規(guī)熱不對稱PCR（常規(guī)引物長度不對稱PCR）：一對引物的堿基數(shù)目與組成不同造成退火溫度不同。將限制性引物比非限制性引物的退火溫度低至少10度。在剛開始的10～15個循環(huán)中，退火溫度略低于限制性引物的退火溫度，產(chǎn)生雙鏈DNA，以耗盡限制性引物；之后的退火溫度便以非限制性引物的退火溫度為準(zhǔn)，大量產(chǎn)生單鏈DNA。 交錯式熱不對稱PCR（TAIL-PCR）：利用一系列序列特異性的巢式引物和一個短的任意引物引導(dǎo)擴(kuò)增，一種半特異性的PCR。16.參考答案:一類能吸收能量，并在1微秒內(nèi)甚至更短將能量以光的形式發(fā)射出來的物質(zhì)。17.參考答案:用異硫氰酸胍-酚-氯仿提取細(xì)胞中的RNA。18.參考答案:PCR的基本工作原理是以擬擴(kuò)增的DNA片段為模板，以一對分別與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸為引物，在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板DNA鏈延伸，直至新的DNA合成。不斷重復(fù)這一過程，則可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。19.參考答案: PCR反應(yīng)不是無窮的進(jìn)行，到了PCR后期，當(dāng)產(chǎn)物達(dá)0.3～1pmol/L時，由于產(chǎn)物的堆積，使原來以指數(shù)增長的速率變成平坦的曲線。 形成原因：由于引物和dNTP的減少，Taq酶失活；或由于底物過剩、非特異性產(chǎn)物的競爭、變性時解鏈不完全、退火時產(chǎn)物單鏈自己締合、最終產(chǎn)物的阻化作用。20.參考答案:缺口平移、DNA快速末端標(biāo)記、用T4多核苷酸激酶(PNK)標(biāo)記DNA5’末端、隨機(jī)引物延伸(DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR，用于大規(guī)模檢測和非放射性標(biāo)記)。21.參考答案:半衰期：一定數(shù)量的放射性同位素原子數(shù)目減少到原來一半時所需要的時間。半衰期越長，說明衰變的越慢；反之越快。半衰期是放射性同位素的特征參數(shù)，不同的放射性同位素有不同的半衰期。22.參考答案: A.變性：雙鏈DNA變成單鏈DNA。變性溫度的高低由G+C含量決定；變性時間由DNA鏈長度決定。常規(guī)PCR變性條件為94～95度45s。 B.退火，將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA退火結(jié)合；退火是使引物和模板DNA復(fù)性。復(fù)性過程采取的溫度（Ta）至關(guān)重要。復(fù)性溫度過高，引物不能與模板很好地復(fù)性，擴(kuò)增效率很低；復(fù)性溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，導(dǎo)致非特異性的DNA片段的擴(kuò)增。退火溫度通常在比理論計算的引物和模板的熔解溫度低3～5℃的條件下進(jìn)行。 C.延伸：寡核苷酸引物的延長，一般在耐熱DNA聚合酶的最適溫度下進(jìn)行。對于Taq酶，為72～78度。 D?循環(huán)數(shù)：PCR擴(kuò)增所需的循環(huán)數(shù)取決于反應(yīng)體系中起始的模板拷貝數(shù)以及引物延伸和擴(kuò)增的效率。 一般擴(kuò)展條件：94℃60s37℃60s72℃120s，共25-30個循環(huán)。23.參考答案: 1、探針的選擇 2、探針的標(biāo)記方法 3、探針的濃度 4、雜交率 5、雜交最適溫度（高溫60～58℃特異性高；低溫50～55℃特異性低） 6、雜交的嚴(yán)格性 7、雜交的反應(yīng)時間 8、雜交促進(jìn)劑24.參考答案: 文庫的庫容量：它是指構(gòu)建出的原始cDNA文庫中所包含的獨立的重組子克隆數(shù)。 意義：它是衡量文庫代表性好壞的量化指標(biāo)。25.參考答案: （1）文庫的代表性：是指文庫中包含的重組cDNA分子是否能完整地反映出來源細(xì)胞中表達(dá)的全部信息（即mRNA種類），是體現(xiàn)文庫質(zhì)量的最重要指標(biāo)。文庫的代表性好壞可用一個量化的指標(biāo)來衡量，即文庫的庫容量，它是指構(gòu)建出的原始cDNA文庫中所包含的獨立的重組子克隆數(shù)。 （2）重組cDNA片段的序列完整性：在細(xì)胞中表達(dá)出的各種mRNA盡管具體的序列不同，但基本上由三個部分組成，即5’端非翻譯區(qū)，中間的編碼序列和3’端非翻譯區(qū)。26.參考答案: A.Klenow片段：為DNA聚合酶Ⅰ的片段，有聚合酶活性和3’~5’外切酶活性（最適37℃）； B.Taq酶：耐熱DNA聚合酶，可耐受93～95攝氏度（最適74-75℃）