幾丁質(zhì)合成與水解酶的抑制劑及抑制機(jī)理

幾丁質(zhì)合成與水解酶的抑制劑及抑制機(jī)理農(nóng)業(yè)蟲害和病害威脅著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與食品安全。高效且環(huán)境友好的農(nóng)藥是治理農(nóng)業(yè)病蟲害的必然選擇。幾丁質(zhì)是植物致病真菌、寄生線蟲和農(nóng)業(yè)害蟲在生長發(fā)育過程中所必需的結(jié)構(gòu)多糖,但是幾丁質(zhì)不存在于高等植物和哺乳動物體內(nèi)。如果通過小分子化合物抑制幾丁質(zhì)合成或水解過程中的關(guān)鍵酶,可以干擾病蟲害的幾丁質(zhì)代謝,但是不影響高等植物和哺乳動物,從而實現(xiàn)對農(nóng)作物的保護(hù)。幾丁質(zhì)的合成與水解需要β-N-乙酰己糖胺酶、幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)合酶等一系列幾丁質(zhì)代謝關(guān)鍵酶參與。本論文分別針對昆蟲β-N-乙酰己糖胺酶、線蟲幾丁質(zhì)酶和真菌幾丁質(zhì)合酶進(jìn)行了抑制劑的篩選與抑制機(jī)理研究,并取得以下主要成果:1)真菌幾丁質(zhì)合酶抑制劑及抑制機(jī)理:真菌是重要的植物致病微生物。論文以模式真菌釀酒酵母幾丁質(zhì)合酶為對象,建立了真菌幾丁質(zhì)合酶抑制劑篩選的方法,篩選得到了一系列新型幾丁質(zhì)合酶抑制劑。其中,化合物S-16對釀酒酵母幾丁質(zhì)合酶較經(jīng)典幾丁質(zhì)合酶抑制劑尼克霉素Z的抑制活性高出了2.5倍。并且,這些幾丁質(zhì)合酶抑制劑在100μg/mL濃度下均表現(xiàn)出了對禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和葫蘆科刺盤孢菌(Colletotrichumlagenarium)等植物致病真菌的抑制活性。接著,根據(jù)同源蛋白纖維素合酶BcsA/B與UDP的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),本論文建立了釀酒酵母幾丁質(zhì)合酶ScCHS1與UDP的結(jié)構(gòu)模型。進(jìn)而,基于幾丁質(zhì)合酶抑制劑與幾丁質(zhì)合酶底物UDP-GlcNAc的結(jié)構(gòu)相似性,推測了抑制劑與幾丁質(zhì)合酶活性中心的結(jié)合方式,即構(gòu)成抑制劑骨架結(jié)構(gòu)的尿苷-酰腙基團(tuán)、GlcNAc模擬基團(tuán)和疏水烷基基團(tuán)三個基團(tuán),分別作用于幾丁質(zhì)合酶催化中心的UDP結(jié)合位點、GlcNAc結(jié)合位點和受體寡糖結(jié)合通道的疏水入口。2)昆蟲β-N-乙酰己糖胺酶抑制劑及抑制機(jī)理:亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)是重要的農(nóng)業(yè)害蟲。本論文針對亞洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶OfHex2進(jìn)行抑制劑的篩選,發(fā)現(xiàn)了具有抑制活性的雙芳香基團(tuán)萘酰亞胺衍生物。其中化合物1-09抑制活性最高,抑制常數(shù)Ki值為0.37μM,較已報道的活性最高的同類抑制劑M-31850的抑制效果提高了7倍。接著,基于人同源酶HsHex的晶體結(jié)構(gòu),建立了OfHex2的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型。進(jìn)而,通過分子對接結(jié)合色氨酸滴定等實驗方法,推測了雙芳香基團(tuán)萘酰亞胺衍生物抑制OfHex2的機(jī)理,即萘酰亞胺衍生物是通過萘酰亞胺基團(tuán)與OfHex2活性中心的色氨酸的堆積作用,另一個芳香基團(tuán)與酶活性口袋外E345上方的疏水區(qū)域的疏水相互作用,以及連接兩個芳香基團(tuán)的橋鏈上的亞胺基團(tuán)與酶催化殘基E345形成的氫鍵作用等三部分相互作用實現(xiàn)抑制。3)線蟲幾丁質(zhì)酶抑制劑及抑制機(jī)理:植物寄生線蟲對農(nóng)業(yè)危害巨大。本論文以模式生物—秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的卵孵化關(guān)鍵幾丁質(zhì)酶CeCht1為靶標(biāo)進(jìn)行了抑制劑的篩選和抑制機(jī)理研究。首先,建立了CeCht1的重組表達(dá)與分離純化方法。然后,針對CeCht1,篩選得到了一系列新型的萘酰亞胺類幾丁質(zhì)酶抑制劑。其中,化合物I-11對CeCht1具有最高的抑制效果,抑制常數(shù)Ki值為4.68μM。接著,以幾丁質(zhì)酶OfChtI的晶體結(jié)構(gòu)為模板,建立了CeCht1的結(jié)構(gòu)模型。基于此模型,通過分子對接,推測了萘酰亞胺衍生物與CeCht1活性口袋的結(jié)合方式,即當(dāng)氨基橋鏈連接兩個芳香基團(tuán)時,萘酰亞胺基團(tuán)結(jié)合到+2位糖基結(jié)合位點附近的疏水區(qū)域,橋鏈另一端的芳香基團(tuán)與W394行成了堆積作用,橋鏈氨基通過氫鍵作用定位于E179附近;當(dāng)化合物只含有萘酰亞胺一個芳香基團(tuán)時,萘酰亞胺基團(tuán)與W394形成了堆積作用,橋鏈氨基通過氫鍵作用被定位于E179和D177之間。綜上,論文工作以幾丁質(zhì)代謝過程中的關(guān)