液體深層發(fā)酵羊肚菌胞內(nèi)多糖提取、結(jié)構(gòu)分析及抗結(jié)腸癌作用研究

液體深層發(fā)酵羊肚菌胞內(nèi)多糖提取、結(jié)構(gòu)分析及抗結(jié)腸癌作用研究羊肚菌(MorchellaesculentaL.)是世界公認(rèn)的珍稀食用菌,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,保健效果顯著,含有多種活性物質(zhì),如多糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、微量元素、膳食纖維、維生素等,具有降血脂、抗疲勞、抗病毒、消炎、抗腫瘤等諸多功效。羊肚菌一直處于野生狀態(tài),人工栽培技術(shù)尚不完善,產(chǎn)量不穩(wěn)定,導(dǎo)致價(jià)格偏高,限制了活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā),尤其是羊肚菌多糖的研究還限于初級(jí)層面,沒(méi)有開(kāi)展深入的功效機(jī)理及分子結(jié)構(gòu)研究。本論文以液體深層發(fā)酵羊肚菌菌絲體為研究對(duì)象,首次使用高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)在室溫下提取菌絲體胞內(nèi)多糖,過(guò)程中無(wú)升溫,保證多糖分子結(jié)構(gòu)的完整性;使用多種除雜、純化技術(shù)得到兩種中性羊肚菌多糖和兩種酸性羊肚菌多糖,鑒于多糖產(chǎn)量和分子量大小的原因,選擇產(chǎn)量高的中性多糖進(jìn)行抗結(jié)腸癌活性研究;通過(guò)檢測(cè)相關(guān)凋亡基因和蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)MEPN-B-Ⅱ通過(guò)兩條路徑激活caspase-3,誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞發(fā)生凋亡,控制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。論文詳細(xì)分析了MEPN-B-Ⅱ分子結(jié)構(gòu),獲得了單糖組成和糖苷鍵信息,并首次觀察到具有抗結(jié)腸癌活性的羊肚菌多糖分子是以一種微球型的微觀形態(tài)存在,多個(gè)分子聚集在一起呈無(wú)定型多晶體狀態(tài)。本論文為深入研究液體深層發(fā)酵羊肚菌多糖生物活性和空間結(jié)構(gòu)打下理論基礎(chǔ),主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下:(1)本論文分別用超聲波-波微協(xié)同法和高壓脈沖電場(chǎng)法兩種技術(shù)提取羊肚菌胞內(nèi)多糖。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化兩種方法的提取工藝條件。超聲波-微波協(xié)同法提取多糖的最佳工藝條件為:超聲功率250W,微波功率220W,提取時(shí)間7min,多糖產(chǎn)量為4.425%。高壓脈沖電場(chǎng)法提取多糖的最佳工藝條件為:電場(chǎng)強(qiáng)度18kV/cm,脈沖數(shù)7,料液比1:27g/mL,多糖產(chǎn)量為5.693%,比超聲波-微波協(xié)同法產(chǎn)量提高了28.66%。通過(guò)掃描電鏡觀察兩種方法提取后的細(xì)胞結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)高壓脈沖電場(chǎng)法提取后細(xì)胞壁破碎徹底,內(nèi)含物溶出充分,而且整個(gè)過(guò)程在常溫下進(jìn)行,羊肚菌多糖分子無(wú)熱降解,提取效率高,耗時(shí)短。本試驗(yàn)證實(shí)高壓脈沖電場(chǎng)適合提取羊肚菌胞內(nèi)活性多糖。(2)提取液中多糖使用乙醇沉淀,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)80%乙醇沉淀效果最好,多糖得率為13.76%;通過(guò)比對(duì),篩選出Sevag法除多糖中蛋白質(zhì),對(duì)多糖分子結(jié)構(gòu)破壞小,多糖得率為70.83?1.79%,脫蛋白率69.29?2.56%;選擇AB-8大孔吸附樹(shù)脂法除色素。間羥聯(lián)苯法測(cè)定羊肚菌多糖中糖醛酸的含量為8.2±0.34%。將除雜后的羊肚菌多糖用DEAE-cellulose離子交換樹(shù)脂分級(jí)純化,得到羊肚菌中性多糖和酸性多糖;用SephadexG-100葡聚糖凝膠層析柱進(jìn)一步分離兩種多糖,得到中性多糖MEPN-A(得率56.3%)、MEPN-B(得率32.5%)和酸性多糖MEPS-A(得率19.15%)、MEPS-B(得率8.82%)。鑒于酸性多糖產(chǎn)量較低,不利于大量制備,后續(xù)試驗(yàn)研究羊肚菌中性多糖。經(jīng)GPC分析,MEPN-A的分子量超過(guò)百萬(wàn),不利于透過(guò)細(xì)胞膜。選擇MEPN-B作為研究對(duì)象,經(jīng)色譜分析,MEPN-B由MEPN-B-Ⅰ和MEPN-B-Ⅱ組成,分子量分別為222,344Da、81,835Da,多糖含量分別為73.56%和92.12%。(3)通過(guò)腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn),比較了MEPN-B-Ⅰ和MEPN-B-Ⅱ體外對(duì)HT-29的抗增殖作用,發(fā)現(xiàn)MEPN-B-Ⅱ具有較高抗結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖作用,其抑制作用與多糖呈量效和時(shí)效關(guān)系。AnnexinV-FITC/PI雙染色檢測(cè)結(jié)果顯示,800μg/mLMEPN-B-Ⅱ可使22.7%HT-29細(xì)胞發(fā)生凋亡。RT-PCR熒光定量技術(shù)分析多糖作用HT-29細(xì)胞后,其Bax基因的表達(dá)量顯著提高了1.07倍,Bid表達(dá)量提高了0.96倍,而B(niǎo)cl-2表達(dá)量則下降0.36倍,導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值上升。推斷MEPN-B-Ⅱ誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的路徑可能是先通過(guò)死亡受體途徑激活caspase-8,從而順式激活下游caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;而活化了的caspase-8開(kāi)始切割Bid,轉(zhuǎn)入線粒體通路,通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá),改變線粒體膜電位,增加膜通透性,促進(jìn)Cyto-C釋放,激活caspase-9,活化caspase-3,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。檢查MEPN-B-Ⅱ?qū)ζ胀ㄈ死w維原細(xì)胞增殖的影響作用,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,證明MEPN-B-Ⅱ?qū)φＨ梭w細(xì)胞無(wú)抗增殖和毒性作用。(4)通過(guò)乙酰化和GC分析,MEPN-B-Ⅱ主要由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成,其摩爾比為10.6:13.1:3.2:29.8:43.3。紫外光譜掃描結(jié)果顯示,多糖中無(wú)蛋白質(zhì)。甲基化、紅外光譜、NMR分析結(jié)果表明:MEPN-B-Ⅱ主要是由→4)Glc(1→,→4)Gal(1→,Glc(1→,→4,6)Gal(1→,→2)Man(1→,→4)Xyl(1→和→2,4)Rha(1→組成。MEPN-B-Ⅱ主鏈的主要單元由α-D-Gal和β-D-Glc構(gòu)成,按1→4方式結(jié)合;分支結(jié)構(gòu)由α-D-Man以1→2結(jié)合而成,非還原性末端為α-D-Glc殘基以1→4的結(jié)合方式與α-D-Man結(jié)合。通過(guò)甲基化分析,α-D-Glc(1→大約占中葡萄糖殘基的20%左右,由此可以推斷MEPN-B-Ⅱ中每一個(gè)重復(fù)單元可能存在2個(gè)支鏈結(jié)構(gòu),一個(gè)分支是由α-D-Man構(gòu)成,末端連接α-D-Glc。SEM掃描結(jié)果表明,MEPN-B-Ⅱ聚合體中每個(gè)單元為近微球的橢圓形狀,緊湊堆積在一起,無(wú)規(guī)則