酶工程第十節(jié)酶與現(xiàn)代生命科學

關于酶工程第十節(jié)酶與現(xiàn)代生命科學

一、酶是分子生物學研究的重要工具

酶是分子生物學研究的重要工具。特別是限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)提供了特異剪切DNA的工具,促進了DNA重組技術誕生,推動了基因工程發(fā)展,成為分子生物學研究的不可缺少的工具.

HindⅡ的識別序列和切割位點

↓

5’---GTPyPUAC–-3’

3’---CAPUPyTG–-5’

↑

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限制性內切酶在基因工程中的應用

基因工程（geneticengineering），也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術。它是根據(jù)人們預先設想，采用酶學的方法，將目的基因（所需要的基因）重組到一個適宜的載體上組成重組子，再將重組子轉化到適當受體細胞中進行擴增表達，以達到改造生物細胞的目的的技術。

基因工程的整個過程由工程菌（細胞）的設計構建和基因產物的生產兩大部分組成。前者主要在實驗室里進行，其單元操作過程如下：第3頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第4頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

基因工程的單元操作過程如下：（1）從供體細胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內切酶分別將外源DNA（包括外源基因或目的基因）和載體分子切開。（2）用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段接到載體分子上，形成DNA重組分子。（3）借助于細胞轉化手段將DNA重組分子導入受體細胞中。（4）短時間培養(yǎng)轉化細胞，以擴增DNA重組分子或使其整含到受體細胞的基因組中。（5）篩選和鑒定轉化細胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達的基因工程菌或細胞。

第5頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

關于限制性內切酶

Restrictionendonueleases

限制性核酸內切酶簡稱限制性內切酶，是一類能識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列并具有專一切割位點的脫氧核糖核酸水解酶。主要存在于細菌、霉菌中，至今已分離到1000種以上，搞清識別序列的有300種以上。第6頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

有關限制性內切酶發(fā)現(xiàn)的幾個重要實驗

50年代初，Luria和Human在研究T4噬菌體感染作用、Bertani和Weigle在研究

和P2噬菌體與宿主細胞關系時，發(fā)現(xiàn)了細菌內限制與修飾現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)了細菌內存在限制修飾系統(tǒng)，在這兩個系統(tǒng)中包括限制酶和修飾酶。限制酶能識別并降解與自身無關的外源DNA，而修飾酶則可通過甲基化修飾自身DNA，免被限制酶降解。

第7頁,共51頁，2024年2月25日，星期天Bertani和Weigle大腸桿菌噬菌體感染實驗

Bertani和Weigle在探索

和P2噬菌體與宿主細胞關系時，均提出了噬菌體感染大腸桿菌后，宿主細胞對入侵的噬菌體DNA表現(xiàn)有特異的限制作用。

?CEcoli.CEcoli.CEcoli.K12大量繁殖受到抑制

第8頁,共51頁，2024年2月25日，星期天Meselson和Yuan實驗

噬菌體

?K12和

?C的DNA分別與由K12菌體制備的細胞抽提物保溫，并藉蔗糖密度梯度離心觀察兩種DNA沉降速度的變化。

?K12DNA

?CDNA加入K12菌體制備的細胞抽提物蔗糖密度梯度離心第9頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

實驗表明，這種限制的本質是宿主細胞K12中存在有能使外來DNA(

?CDNA)有限降解的核酸水解酶。

此后，又進一步證實了大腸桿菌K12中的修飾體系即為甲基化酶，該酶修飾了

?K12DNA上的特異部位，使其不被限制體系的酶切割。結論表明：第10頁,共51頁，2024年2月25日，星期天1965年阿爾伯首次從理論上提出了生物體內存在著一種具有切割基因功能的限制性內切酶。并于1968年成功分離出I型限制性內切酶與修飾酶。證實在細菌內存在兩種不同功能但又相關的酶。1970年史密斯從流感噬血桿菌d株中分離出了II型限制性內切酶；同年內森斯使用該酶降解獼猴腫瘤病毒SV40的DNA，首次完成了對基因的切割，排列了酶切圖譜。從此成為分子克隆技術中不可缺少的工具酶，推動了基因工程的發(fā)展。1978年，上述三人因對限制性內切酶的貢獻獲得諾貝爾獎。第11頁,共51頁，2024年2月25日，星期天阿爾伯(1929～)瑞士微生物遺傳學家

H.O.史密斯(1931～)美國分子生物學家、遺傳學家

內森斯(1928～)美國微生物遺傳學家

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限制性內切酶命名規(guī)則

限制酶的命名從其來源微生物的拉丁名中摘取，即由其屬名的第一個字母(大寫)與種名的第一、二兩個字母(小寫)組成酶的基本命名，若酶的產生菌有株系之分，則有4個或4個以上拉丁字母組成，其第四個字母之后表示株系。如EcoRI來源于Echerichia.coli

RY13BamHI來源于B.amyloliquefaciens第13頁,共51頁，2024年2月25日，星期天HindIIHaemophilus(屬名)Influenzae(種名)d(株系)羅馬數(shù)字限制性內切酶命名舉例第14頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

限制性內切酶分類已發(fā)現(xiàn)的限制酶可以分為三類或稱作三型：I、II、III型。他們在酶反應中所需要的輔因子和切割DNA的位點都不相同，而且酶蛋白分子的大小和組成上也有差別。第15頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

類別反應必須因子專一性

活性I型S-腺苷基蛋氨酸，ATP，Mg2+識別部位和切點不同，無特定切割位點內切甲基化II型Mg2+切斷識別部位或其附近的特定部位只有限制酶活性III型ATP，Mg2+識別部位和切點不同，但切斷特定部位內切甲基化限制性內切酶分類第16頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

二、

II型限制性內切酶的特性

II型限制酶的識別特異性

回文識別序列

II型限制酶的識別序列大多是具有雙重對稱結構性結構,或稱回文序列

(PalindromicSequence)第18頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

非典型回文識別序列

回文識別序列被一至幾個其他核苷酸（N）所間隔，得到的是非典型的雙軸對稱性序列。

BglI

GCCNNNN

NGGCMstII

CC

TNAGG第19頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

非回文識別序列

也有些限制酶識別序列非回文結構，切割位點在距識別序列5至13個bp處。5’GACGCNNNNN

3’3’CTGCGNNNNNNNNNN

5’例：HgnI

GACGC第20頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

有些限制酶可識別多重序列。如：HindII，識別序列為GTPyPuAC，可識別三種序列。GTPyPuACGTCAACGTCGACGTTAACGTTGAC嘌呤（Purine）嘧啶（Pyrimidine）類似的內切酶還有AccI、AvaI、BanI、HaeI等，它們的特異性低于單一識別序列的酶。第21頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

識別序列的長度與剪切頻率

大部分II型限制性內切酶的識別序列長度為4-8個核苷酸。識別長度決定了剪切DNA的頻率（1/4n，n為識別的長度）。識別長度愈長，則切點少、產生片段少而長度長，酶特異性高。第22頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

限制酶的切割特異性和酶切片段的末端結構

切割位點專一作為工具酶的限制性內切酶有固定的切割位點；

產物具有特定的末端結構當一個DNA分子被限制酶切開后形成兩個末端，全部產物具有相同的末端結構。即一種限制性內切酶切割任何DNA只產生一種固定形式的末端結構，在DNA連接酶的作用下，磷酸二酯鍵可以修復而成為一個重組的DNA分子；而不同限制酶則形成不同末端結構。5’-G3’-CTTAA

+AATTC-3’G-5’5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

DNA連接酶5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’第23頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

任何一種限制酶切割DNA鏈時，總是水解核苷酸

3’、5’-磷酸雙酯鍵的3’位磷酸酯鍵，使產物的5’端帶磷酸單酯基團，而3’為游離羥基。

由于切割位點不同，所有的限制酶可產生兩類末端結構

①平末端（BluntEnd）指酶切片段為齊頭末端結構。②粘性末端（CohesiveEnd）酶切后DNA片段末端帶有

1-4個核苷酸殘基長度的單鏈結構，而片段兩端突出的單鏈具有互補的序列。粘性末端又可分為5‘-粘性末端與

3’-粘性末端。

5’

NOH3’

5’PO4N3’第24頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共51頁，2024年2月25日，星期天粘性末端3’-粘性末端5’-粘性末端平末端5’-G

AATTC-3’3’-CTTAA

G-5’EcoRI

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-CTGCA

G-3’3’-G

ACGTC-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’5’-CCC

GGG-3’3’-GGG

CCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’第26頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

有沒有例外？（1）相同的限制性內切酶不總是產生匹配的片段A）含多重識別序列的限制酶

如

HindII在順序GTPyPuAC

剪切，可產生3種不同類型片段，互相連接的可能性為1/3。B）含非典型識別序列的限制酶如EcoNI在順序CCTNNNNNAGC剪切，N可以是任何核苷酸，由于N的隨意性，往往會產生不廣泛匹配的片段。C）在次理想條件下，限制酶表現(xiàn)出星狀活性，影響正常匹配。第27頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

（2）不同的限制性內切酶有時可以產生匹配的片段

例：BamHIG

GATCC BclIT

GATCA BglIIA

GATCT

這類能產生相同粘性末端而識別特異性不同的限制酶稱作同尾限制酶（Isocaudarner）。同尾限制酶產生的DNA片段可借DNA連接酶互相重組，但新產生的雜合序列將不再被原有的限制酶所識別。

5’-G

GATCT-3’

DNA

5’-GGATCT-3’

3’-CCTAG

A-5’

連接酶

3’-CCTAGA-5’

(BamHI片段)(BglII片段)(產生雜合識別序列)第28頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

酶反應條件

按手冊或商品說明書反應緩沖液：根據(jù)不同酶使用高、中或低鹽緩沖液。常用的緩沖液選擇Tris-Hcl

。同時還要加入Mgcl2

和2-巰基乙醇。反應溫度：一般限制性內切酶的反應溫度是37○c。酶活性單位：1個酶活性單位是指一種酶在其最適宜的反應條件下，1小時使1μgλ噬菌體DNA

底物完全水解的酶量。但由于許多因素可影響內切酶的水解反應和用量，實際用量需比所需用量多加一倍左右。第29頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

第二活性

在次理想條件下,一些限制性內切酶的特異型會被降低,只有部分正常識別位置被識別,此稱為第二活性（SecondaryActivity），也稱星號活性（StarActivity），加以“*”表示，如EcoRI*。酶的第二活性將引起底物DNA鏈上切口增多，酶解片斷變小，造成特異性降低。例：理想條件下（PH=7.5）EcoRIG

AATTC

次理想條件下（PH=8.5）EcoRI*

AATT次理想條件：通常包括不適合的離子強度、過高的PH、二價金屬離子的替換、較高的甘油濃度等。第30頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

限制酶的保質期

一般是在檢定日以后的一年內，但幾乎所有的限制酶在超過保質期后都不會急劇失活,因此購入后即使是經過長時間保存的酶,也完全可以使用，但這些酶在使用前最好再測一次活性。另外，保存酶時即便讓其凍結，大部分酶也不會急劇失活。第31頁,共51頁，2024年2月25日，星期天EcoRI第32頁,共51頁，2024年2月25日，星期天PstI第33頁,共51頁，2024年2月25日，星期天SmaIreturn第34頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

研究酶的理化性質及其作用原理，對于闡明生命現(xiàn)象的本質和規(guī)律具有十分重要的意義（包括酶的結構功能、酶與代謝調節(jié)、酶與生物的生長、發(fā)育、進化、疾病等）。

從酶分子水平去探討酶與生命活動、與代謝調節(jié)、與疾病、生長發(fā)育等等的關系，對闡明某些生命活動的本質和規(guī)律，無疑也具有十分重要的意義。

二、酶是生命科學研究的重要對象第35頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

同功酶同工酶(isoenzyme)是指催化的化學反應相同，而酶蛋白的分子結構、理化性質乃至免疫學性質不同的一組酶,存在于生物的同一種屬或同一個體的不同組織、甚至同一組織或細胞中。目前已發(fā)現(xiàn)有150多種酶具有同工酶，如6-磷酸葡萄糖脫氫酶、乳酸脫氫酶、酸性和堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶、肌酸磷酸激酶、核糖核酸酶、過氧化酶和膽堿酯酶等。其中，發(fā)現(xiàn)最早，研究最多的是乳酸脫氫酶（LDH）同工酶.第36頁,共51頁，2024年2月25日，星期天例：LDH同工酶的兩種亞基以不同比例組成五種四聚體：LDH1(H4)、LDH2(H3M)、LDH3(H2M2)、LDH4(HM3)和LDH5(M4)。

DogfishLDHM4結構圖

第37頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

同功酶與物種進化

同工酶是生物進化過程中為適應愈趨復雜的代謝而引起的一種分子進化，以適應不同組織或不同細胞器在代謝上的不同需要.

同功酶在各器官和組織中的分布不同。這樣就可以根據(jù)同工酶酶譜差異并配合其它方法從分子水平探討物種進化、遺傳變異等一些生命現(xiàn)象。第38頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

在正常情況下血清中同功酶譜是相對穩(wěn)定的。當某一組織或器官發(fā)生病變時，就有某種特殊的同工酶釋放出來，引起血清中同功酶活性的改變。對病人及正常人同工酶電泳圖譜進行比較，有助于上述器官疾病的診斷。

在臨床上已應用同工酶做診斷指標,例如:

冠心病及冠狀動脈血栓引起的心肌受損者血清中LDH(H4)及LDH2(MH3)含量增高;

而肝細胞受損患者血清中LDH5(M4)增高。第39頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

同功酶與其它

同工酶的研究不僅在臨床血液病、腫瘤及其它疾病的診斷方面占有重要地位，而且在分子遺傳學、物種鑒定、法庭取證、親子鑒定、優(yōu)生優(yōu)育等領域中也具有廣闊的應用前景。

第40頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

腫瘤的酶異常

腫瘤酶異常原因：1、腫瘤過多或過少產生酶2、腫瘤阻塞了酶通過的導管系統(tǒng)3、腫瘤誘導酶產生4、細胞通透性改變使可溶性酶進入血液循環(huán)

第41頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

臨床診斷還沒有單一指標可確診癌，所以酶測定可作為一種輔助手段，如：測定血清淀粉酶——胰腺癌酸性磷酸酶——前列腺癌亮氨酸氨肽酶、硫酸酯酶、乳酸脫氫酶等同工酶譜變化———肝癌、結腸癌、直腸癌。第42頁,共51頁，2024年2月25日，星期天端粒酶

端粒、端粒酶與腫瘤發(fā)生的關系是近年來腫瘤研究領域的熱點之一。有研究表明,端粒酶在85%～95%的惡性腫瘤組織中有陽性表達,而在正常體細胞則一般為陰性。因此端粒酶抑制劑的研究為惡性腫瘤的早期診斷、預后估計及基因治療開辟了一個新的途徑。第43頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

端粒(telomere)

真核細胞染色體末端以TTAGGG6個堿基序列重復組成的DNA結構人體細胞染色體端粒長度約為5～15Kb,其功能在于保護染色體免受核酶降解,防止斷端融合重排或降解。如果端粒長度縮短到極限如4Kb以下時,細胞則會喪失分裂增殖能力而發(fā)生凋亡,該過程稱為監(jiān)控點激活(checkpointactivation)。端?？s短被認為是正常細胞分裂與老化的分子信號,端粒被稱為細胞壽命的“分裂鐘”。第44頁,共51頁，2024年2月25日，星期天端粒的保護機制

在真核細胞,端粒DNA的富G鏈較富C鏈超出約12～16bp,形成3′端的突出單鏈結構,而端粒蛋白質能夠特異地識別這一突出區(qū)域并與之結合,再通過進一步的折疊、盤曲,從而形成染色體末端具有保護功能的“帽子”,在防止染