熒光顯微成像技術和應用

關于熒光顯微成像技術和應用原理

普通光學顯微鏡通過普通光源的照明觀察標本第2頁,共16頁，2024年2月25日，星期天熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)：

利用較短波長的光(激發(fā)光)照射樣品，使樣品受到高能量激發(fā)，產生較長波長的熒光(發(fā)射光)，用來觀察和分辨樣品中產生熒光的物質的成分和位置。第3頁,共16頁，2024年2月25日，星期天熒光顯微鏡的種類透射式落射式第4頁,共16頁，2024年2月25日，星期天

目鏡吸收濾色鏡

物鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡

汞燈透射熒光顯微鏡原理圖標本第5頁,共16頁，2024年2月25日，星期天汞燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡

標本落射熒光顯微鏡原理圖第6頁,共16頁，2024年2月25日，星期天

透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡暗場聚光鏡吸收濾色鏡

落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡熒光顯微鏡的主要部件第7頁,共16頁，2024年2月25日，星期天分色鏡反射激發(fā)光，透過熒光暗場聚光鏡來自下面光源的光線經過暗場聚光鏡，形成了橫過顯微鏡視野而不進入物鏡的強烈光束。因此視野是暗的第8頁,共16頁，2024年2月25日，星期天熒光圖像的記錄方法熒光顯微鏡所看到的熒光圖像具有：形態(tài)學特征和熒光的顏色、亮度判斷結果時，必須將二者結合起來綜合判斷

記錄結果：主觀指標（即工作者目力觀察）客觀指標（細胞分光光度計、圖像分析儀等）第9頁,共16頁，2024年2月25日，星期天熒光顯微鏡應用技術1.對細胞結構或組分的定性位、半定量研究免疫熒光技術用熒光標記的抗體或抗原與樣品(細胞、組織或分離的物質等)中相應的抗原或抗體結合，以適當檢測熒光的技術對其進行分析的方法。將抗原或抗體與熒光染料連接，用于檢測相應特異性的抗體或抗原的方法稱“直接免疫熒光技(directimmunofluorescenttechnique)”。用熒光染料標記的第二、第三抗體等檢測相應抗原抗體復合體的方法則稱“間接免疫熒光技術(indirectimmunofluorescenttechnique)”。第10頁,共16頁，2024年2月25日，星期天由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進行細胞定位第11頁,共16頁，2024年2月25日，星期天2.作為生物大分子篩選與鑒定的標記物。綠色熒光蛋白綠色螢光蛋白(greenfluorescentprotein)，簡稱GFP，其基因所產生的蛋白質，在藍色波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出綠色螢光，在生物學研究中綠色熒光蛋白具有廣泛用途，包括有第12頁,共16頁，2024年2月25日，星期天

1.分子標記利用綠色熒光的發(fā)光機制，可將GFP作為蛋白質標簽(proteintagging)，即利用DNA重組技術，將目的基因與GFP基因構成融合基因，轉染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質進行細胞內活體觀察第13頁,共16頁，2024年2月25日，星期天2.藥物篩選熒光探針分布是利用信號傳導中信號分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號分子相偶聯，根據熒光蛋白的分布情況即可推斷信號分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細胞內可溶且對細胞毒性較小，因而常用作熒光探針第14頁,共16頁，2024年2月25日，