病理組織切片技術(shù)

關(guān)于病理組織切片技術(shù)

病理組織制片技術(shù)

定義要實(shí)現(xiàn)對(duì)病變組織的顯微鏡形態(tài)學(xué)檢查，需要將獲得的病變組織制片。我們將切片制作所采用的一系列技術(shù)。第2頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天組織制作基礎(chǔ)制作流程封片染色烤片貼片展片切片包埋浸蠟透明脫水洗滌固定取材第3頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、取材

定義

按照病理檢查的目的和要求，切取適當(dāng)大小和數(shù)量的組織塊，用于制作組織切片的過(guò)程。切片刀第4頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天取材

要求(1)材料新鮮：取材組織愈新鮮愈好，人體組織一般在離體后，動(dòng)物組織在處死后迅速固定，以保證原有的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。(2)組織塊的大?。核〗M織塊較理想的體積為2.0cm×2.0cm×0.3cm，以使固定液能迅速而均勻地滲入組織內(nèi)部，但根據(jù)制片材料和目的不同，組織塊的較理想體積也不同，如制作病理外檢、科研切片，其組織塊可以薄取0.1～0.2cm即可，這樣可以縮短固定脫水透明的時(shí)間，若制作教學(xué)切片厚取0.3～0.5cm，這樣可以同一蠟塊制作出較多的教學(xué)切片。(3)勿擠壓組織塊:切取組織塊用的刀剪要鋒利，切割時(shí)不可來(lái)回銼動(dòng)。夾取組織時(shí)切勿過(guò)緊，以免因擠壓而使組織、細(xì)胞變形。第5頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天4)規(guī)范取材部位:要準(zhǔn)確地按解剖部位取材，病理標(biāo)本取材按照各病變部位、性質(zhì)的不同，根據(jù)要求規(guī)范化取材。(5)選好組織塊的切面:根據(jù)各器官的組織結(jié)構(gòu)，決定其切面的走向。縱切或橫切往往是顯示組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，如長(zhǎng)管狀器官以橫切為好。(6)保持材料的清潔:組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等，可用水沖洗干凈后再放入固定液中。(7)保持組織的原有形態(tài):新鮮組織固定后，或多或少會(huì)產(chǎn)生收縮現(xiàn)象，有時(shí)甚至完全變形。為此可將組織展平，以盡可能維持原形。第6頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天取材臺(tái)第7頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、固定

定義

將組織浸入某些化學(xué)試劑。使組織細(xì)胞內(nèi)所含物質(zhì)盡量保持在生活狀態(tài)時(shí)形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置的過(guò)程。第8頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天

固定

目的防止自溶和腐敗凝固或沉淀細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)硬化組織增加組織的折光率第9頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定

方法(1)小塊組織固定法：這是最常用的方法，從人體或動(dòng)物體取下的小塊組織，須立即置入液態(tài)固定劑中進(jìn)行固定，通常，標(biāo)本與固定液的比例為1:4～20，但組織塊不宜過(guò)大過(guò)厚，否則固定液不能迅速滲透。故取組織塊的大小一般為2.0cm×2.0cm×0.3cm。(2)注射、灌注固定法：某些組織塊由于體積過(guò)大或固定液極難滲入內(nèi)部，或需要對(duì)整個(gè)臟器或整個(gè)動(dòng)物體進(jìn)行固定。這時(shí)宜采用注射固定或灌注固定法。將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到達(dá)整個(gè)組織和全身，從而得到充分的固定。(3)蒸汽固定法：比較小而厚的標(biāo)本，可采用鋨酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂片，則應(yīng)在血片未干燥前采用鋨酸或甲醛蒸汽接觸固定。第10頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用固定液

特性滲透力強(qiáng)，能迅速滲入組織內(nèi)部不會(huì)使組織過(guò)度收縮或膨脹能硬化、固定組織，使細(xì)胞成分的形態(tài)和位置與生活狀態(tài)時(shí)相似。使組織對(duì)染料產(chǎn)生較強(qiáng)的親和力，并產(chǎn)生較佳的折光率。第11頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的固定液?jiǎn)渭児潭ㄒ?0%甲醛（福爾馬林）：甲醛濃度為40%，指10ml甲醛加入90ml的水配成的。乙醇（80%~90%最好）乙酸（醋酸、冰醋酸）紅色字體為常用固定液固定液第12頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天中性甲醇液：甲醛120ml，蒸餾水880ml，磷酸二氫鈉4g，磷酸氫二鈉13g配制而成，PH值達(dá)到７。此固定液是人體組織和動(dòng)物組織常用之固定液，特別是作免疫組織化學(xué)染色固定時(shí)效果較好。乙醇-醋酸-甲醇液乙醇-甲醇液（AF液）：

95%或無(wú)水乙醇90ml，40%甲醛10ml配制而成Bouin液Zenker液混合固定液紅色字體為常用固定液第13頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定的注意事項(xiàng)及時(shí)固定（夏天超過(guò)4h，冬天超過(guò)24h組織會(huì)干涸、自溶、腐敗。）固定容器宜大固定液應(yīng)足量（為被固定組織體積的10~20倍）防止組織變形確定恰當(dāng)?shù)墓潭〞r(shí)間（12~24h）固定液第14頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天組織固定的常見(jiàn)問(wèn)題

固定液使用時(shí)間較長(zhǎng)，有效濃度降低固定時(shí)間正常，但固定時(shí)間效果差固定液的量不足

標(biāo)本過(guò)薄標(biāo)本扭曲變形，過(guò)脆過(guò)硬固定液濃度過(guò)高，過(guò)程過(guò)強(qiáng)固定時(shí)間長(zhǎng)標(biāo)本之間重疊或與容器壁、底部緊貼標(biāo)本局部固定不良標(biāo)本過(guò)多，容器太少標(biāo)本輕，漂浮于固定液面

標(biāo)本過(guò)大，過(guò)厚標(biāo)本中心固定不透固定液滲透力強(qiáng)，濃度高使組織表層迅速硬化固定時(shí)間短固定液失效第15頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定不充分固定充分第16頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、洗滌、脫水、透明第17頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天洗滌

定義用水或乙醇等組織經(jīng)過(guò)固定處理后，未與組織結(jié)合的固定液及沉淀物清洗掉的過(guò)程。第18頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天洗滌

目的去掉未與組織結(jié)合的固定液及沉淀物避免組織中留有較多的固定液而妨礙脫水組織中生成的沉淀物或結(jié)晶而影響染色和觀察可減少甲醛色素第19頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天洗滌的方法含水固定液的洗滌方法（常用的是甲醛，用自來(lái)水沖洗即可）含乙醇固定液的洗滌方法（用乙醇或乙醇混合液固定的組織，一般不需要清洗）特殊固定液的洗滌方法（使用的固定液不同，洗滌的方法也不一樣）第20頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天脫水

定義標(biāo)本經(jīng)過(guò)固定和沖洗后，組織中含有較多的水分，必須將組織塊內(nèi)的水分置換出來(lái)，這一過(guò)程。第21頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天無(wú)論是用石蠟切片，還是用火棉膠切片，都必須除去組織中所含水分，因含水組織與石蠟、火棉膠等包埋材料不相容，常用的脫水劑為一系列不同濃度的乙醇。第22頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天及時(shí)的進(jìn)行核對(duì)第23頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天脫水

目的組織塊經(jīng)鞏固定和水洗后，含有大量水分，而水與苯、二甲苯等透明劑不混溶,故在組織前必須用能與透明劑相混合的脫水劑(如乙醇等),把組織內(nèi)的水分置出來(lái),為下一步做準(zhǔn)備。第24頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的脫水劑乙醇（最常用的脫水劑）沸點(diǎn)78.4℃，脫水能力強(qiáng)，能硬化組織，可較好地與二甲苯混合。脫水的步驟是：80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇2小時(shí)，此過(guò)程可用脫水機(jī)自控完成。柔嫩組織的脫水應(yīng)從50%或30%乙醇開(kāi)始組織在高濃度乙醇（無(wú)水乙醇）中留置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。第25頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天丙酮沸點(diǎn)56℃，可用于染色前后的脫水，對(duì)組織的脫水作用，收縮作用均比乙醇強(qiáng)，價(jià)格較高，一般很少單純使用。第26頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天丙酮也是一種脫水能力很強(qiáng)的脫水劑，但因其脫水能力很強(qiáng)，對(duì)組織有劇烈收縮作用，在制作科研、教學(xué)切片時(shí)一般不用該試劑。因乙醇、丙酮等不溶于石蠟，還要經(jīng)過(guò)一個(gè)能溶于石蠟的溶劑替代過(guò)程稱為透明。常用的透明劑有二甲苯、三氯甲烷、水楊酸甲酯等第27頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天異丙醇是乙醇的良好的代用品，不含水，可代替無(wú)水乙醇。第28頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天脫水的方法自低到高溶度依次進(jìn)行，使組織中所含水分逐漸減少直至被脫水劑代替。第29頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天脫水機(jī)第30頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天透明

定義用某些化學(xué)試劑將組織中的脫水劑置換出來(lái)，以利于浸蠟和包埋，因組織塊浸入這此試劑后常呈半透明狀第31頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天透明

目的透明是制片過(guò)程中很重要的環(huán)節(jié)。大多數(shù)脫水劑不能和包埋劑（如石蠟）混溶，而透明劑即可與脫水劑混溶，又能和包埋劑（如石蠟）混溶，能起到橋梁作用。第32頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的透明劑苯甲苯二甲苯（最常用的透明劑）三氯甲烷汽油香柏油冬青油松油醇第33頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的透明

方法將脫水后的組織塊先用乙醇-二甲苯混合液處理或直接浸入透明劑中，置換透明劑2~3次即能達(dá)到目的。透明的時(shí)間的長(zhǎng)短取決于標(biāo)本的種類和組織塊的厚薄，一般活檢標(biāo)本透明15~20min即可。第34頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、浸蠟、包埋第35頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天浸蠟

定義經(jīng)過(guò)透明的組織塊在溶化的石蠟中浸漬，使組織中的透明劑被完全置換出來(lái)的過(guò)程第36頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天浸蠟的

目的使石蠟浸入組織中，取代組織中含有的透明劑。第37頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天浸蠟的

種類石蠟明膠火棉膠樹(shù)脂碳蠟又是包埋劑。既是透明劑，第38頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天浸蠟的方法熔點(diǎn)：56~58℃溫度：58~60℃（高于石蠟熔點(diǎn)2~3℃）第39頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天浸蠟的

注意事項(xiàng)

首先，應(yīng)保證所用石蠟的質(zhì)量，盡量不含雜質(zhì)，否則易造成切片刀刀口受損或切片破碎、劃痕增多。其次，浸蠟用的石蠟熔點(diǎn)應(yīng)控制在55~58℃。蠟溫過(guò)低，浸蠟不良；蠟溫過(guò)高回燙傷組織，是組織收縮、變硬、切片時(shí)易脫片、卷片。再次，要控制好浸蠟時(shí)間。時(shí)間過(guò)短，蠟沒(méi)有完全滲入組織、組織過(guò)軟；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成組織硬脆。兩者均可造成切片困難。另外，應(yīng)盡量去除沾在組織上的二甲苯，在浸蠟。第40頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天浸蠟機(jī)第41頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天包埋

定義將浸蠟后的組織置于融化的固體石蠟中，石蠟?zāi)毯?，組織即被包在其中稱蠟塊，此過(guò)程稱為包埋。第42頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天包埋的目的有利于組織塊的妥善保存有利于切成薄片可使組織具有一定硬度和韌性第43頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天包埋方法石蠟包埋法（最常用）火棉膠包埋法碳蠟包埋法明膠包埋法第44頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天包埋的注意事項(xiàng)

包埋時(shí)，框要比組織塊大，保證蠟塊組織周圍都有蠟邊，對(duì)管、腔、壁組織要垂直包埋，而胃、腸、膽囊等組織，應(yīng)將能看到的組織學(xué)各層面作為切面，其他組織則將切面朝下，小塊多顆組織盡量放在一起并保持在同一水平面；包埋的蠟質(zhì)不能含有雜質(zhì)、紙絮、縫線等異物，最好是經(jīng)過(guò)多次溶化、沉淀過(guò)的蠟。以利于切片。第45頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天

包埋機(jī)第46頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天組織包埋盒第47頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、切片第48頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的切片方法石蠟切片冰凍切片火棉膠切片第49頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天切片前準(zhǔn)備(1)修整蠟塊可視其組織的大小，在組織邊緣約0.1～0.2cm處，切去余蠟部分。否則易造成組織皺縮不平。第50頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)準(zhǔn)備好切片用具

切片刀毛筆眼科鑷子（彎）漂烘溫控儀第51頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)安裝蠟塊將修好的蠟塊安裝在金屬或木制持蠟器上

第52頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天(4)安裝切片刀將切片刀安裝在切片機(jī)的刀臺(tái)上，把刀臺(tái)上的緊固螺絲旋緊，使切片時(shí)不產(chǎn)生振動(dòng)，能保持一定的切片厚度組織切片刀

第53頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天(5)切片的厚度切片機(jī)的厚度調(diào)節(jié)器上刻有0～50μm或0～25μm，可任意選擇其厚度，石蠟切片的厚度一般在4～6μm

第54頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天切片制作過(guò)程將切片刀安裝于刀架上（調(diào)整好刀的角度，一般為20~30°左右）將蠟塊固定在切片組織塊夾具上調(diào)整組織塊夾具的調(diào)節(jié)蠟旋，使蠟塊切面與刀口平行。先粗修（30～50um

）細(xì)修（10um

）第55頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天切片的注意事項(xiàng)切片前蠟塊要冷凍，但不能把剛包埋好的熱蠟塊冷凍，否則蠟塊會(huì)產(chǎn)生裂痕，一夾就碎。蠟塊裝機(jī)時(shí)，應(yīng)注意組織包埋的方向，組織的層次、纖維、肌肉等走向應(yīng)與切片刀平行。蠟塊在切片機(jī)固定加緊后要修塊，組織塊上下留邊各2mm第56頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天蠟片厚度一般在3-5um同一把切片刀每次要固定角度切片有縱紋,可能與切片刀有小缺口或修塊時(shí)未把雜物去除,以及石蠟不潔有關(guān)第57頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天切片機(jī)第58頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、展片第59頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天展片

定義連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)輪，切片的蠟片相連成狀，需要將其展平整才能貼在載玻片上，此過(guò)程為展片。第60頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天展片第61頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天撈片展片困難時(shí)，可先將蠟帶放入30%乙醇處展，在用載玻片撈起蠟帶放入溫水中。待蠟帶中的組織完全展平后，即可將其撈出，稱為撈片。第62頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天撈片第63頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、貼片、烤片第64頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天貼片、烘片待切片在恒溫水面上充分展平后，將蠟片撈到載玻片的中段處傾去載玻片上的余水，置入60～65℃恒溫箱內(nèi)或切片漂烘溫控儀的烘箱內(nèi)烤片15～30分鐘，脫去溶化組織間隙的石蠟。第65頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天烤片機(jī)第66頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天七、染色第67頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天染色

定義用染液對(duì)組織切片進(jìn)行處理，使組織中的不同成分被染上相應(yīng)的顏色，產(chǎn)生不同的折射率，以利于顯微鏡觀察和分析的方法。第68頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的染色方法蘇木素-伊紅（Hematoxylin-Eosin）染色法簡(jiǎn)稱H.E染色法。這種方法對(duì)任何固定液固定的組織和應(yīng)用各種包埋法的切片均可使用。第69頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天蘇木素是一種堿性染料,可使組織中的嗜堿性物質(zhì)染成藍(lán)色，如細(xì)胞核中的染色質(zhì)等；伊紅是一種酸性染料，可使組織中的嗜酸性物質(zhì)染成紅色，如多數(shù)細(xì)胞的胞質(zhì)、核仁等在H.E染色的切片中均呈紅色。第70頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天H.E染色程序如下脫蠟脫苯復(fù)水染色脫水透明封固第71頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天切片脫水透明要徹底ＨＥ染色后，要徹底脫水透明，才能進(jìn)行樹(shù)膠封蓋，成為永久標(biāo)本。如果脫水透明不徹底，封片后呈白色霧狀，鏡下模糊不清，過(guò)一段