細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)范

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)范一：細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件：1.無菌環(huán)境：細(xì)胞培養(yǎng)間消毒a：使用前紫外照射20-30分鐘b：使用完75%酒精擦拭臺面，紫外照射15分鐘。c：每兩周用84消毒液擦拭地面、臺面一次的方式進(jìn)行消毒第2頁,共27頁，2024年2月25日，星期天超凈工作臺：使用前開啟柜內(nèi)紫外燈照射15－30分鐘使用時開啟鼓風(fēng)，在臺面內(nèi)操作使用完畢后要用75%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈，紫外照射10分鐘。第3頁,共27頁，2024年2月25日，星期天CO2

培養(yǎng)箱：1.設(shè)定的條件為37℃，5％CO2。2.使用CO2培養(yǎng)箱應(yīng)注意的問題：?用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。?保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈，定期消毒擦拭。?箱內(nèi)蒸餾水槽中定期更換滅菌蒸餾水3000毫升，以保持箱內(nèi)濕度。第4頁,共27頁，2024年2月25日，星期天控制水盤內(nèi)污染的方法：

1、

定期(至少每兩周一次)，更換水盤內(nèi)的無菌蒸餾水或無菌去離子水。2、

在水盤內(nèi)添加適量硫酸銅，預(yù)防真菌污染。配制方法：20g無水硫酸銅＋5ml濃硫酸＋1L滅菌純水。3、

水盤內(nèi)添加適量抗生素。

4、定期為培養(yǎng)箱（含水盤）進(jìn)行一次高溫滅菌。第5頁,共27頁，2024年2月25日，星期天2.細(xì)胞培養(yǎng)條件細(xì)胞培養(yǎng)器皿：細(xì)胞培養(yǎng)瓶：?25平方厘米（加液量3-5ml）?75平方厘米（加液量10-15ml）?150平方厘米（加液量40ml）細(xì)胞培養(yǎng)板：第6頁,共27頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)皿?35mm（加液量3ml)?60mm（加液量5ml)?100mm（加液量10ml)150mm

(加液量15ml)第7頁,共27頁，2024年2月25日，星期天常用培養(yǎng)基：RPMI1640：適合許多種細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。尤其適合人白細(xì)胞，如H9、HL-60、IM-9和K-562等細(xì)胞系的培養(yǎng)。DMEM：DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型（4500mg/L）、除菌過濾滅菌】DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型(1000mg/L)、除菌過濾滅菌】第8頁,共27頁，2024年2月25日，星期天血清：常用血清種類：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）56℃，30分鐘。使用濃度：5%-20%，一般10%血清的消毒：過濾除菌血清解凍步驟：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般用15ml無菌離心管分裝。第9頁,共27頁，2024年2月25日，星期天谷氨酰胺：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃放置1周可分解50％，故應(yīng)單獨配制，置于-20℃保存，臨用前加入培養(yǎng)液。第10頁,共27頁，2024年2月25日，星期天消化液：胰蛋白酶溶液：常用濃度：0.25%。消化時間：2-10分鐘（顯微鏡下觀察）用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用。第11頁,共27頁，2024年2月25日，星期天EDTA溶液使用濃度：?0.02%，與胰蛋白酶配合使用。?EDTA不能被血清中和，終止消化后，需用培養(yǎng)液或PBS徹底沖洗培養(yǎng)瓶。第12頁,共27頁，2024年2月25日，星期天二：細(xì)胞培養(yǎng)前準(zhǔn)備工作：1.相關(guān)耗材：

細(xì)胞培養(yǎng)皿（瓶）若干、離心管（15ml,50ml）、100ml玻璃瓶4個、500ml玻璃瓶4個、2mL凍存管、tip頭及槍頭盒、吸管（10ml刻度）、吹打管、50ml、10ml、5ml注射器、一次性針孔過濾器（0.22um）、一次性口罩、帽子、手套、紗布、牛皮紙、標(biāo)簽紙第13頁,共27頁，2024年2月25日，星期天2.相關(guān)試劑及配制方法：細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)試劑配制均在超凈工作臺上操作，嚴(yán)格按照無菌操作流程！完全培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基90%

血清10％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素100U／ml過濾除菌4℃保存使用時加入谷氨酰胺（配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。第14頁,共27頁，2024年2月25日，星期天胰蛋白酶-EDTA消化液稱取0.25g的胰蛋白酶和0.02g的EDTA用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液或D-Hank’s配制，用濾器過濾除菌，-20℃分裝保存。細(xì)胞凍存液配制：90%血清和10%DMSO第15頁,共27頁，2024年2月25日，星期天3：常用培養(yǎng)器皿的清洗及消毒玻璃器皿的清洗刷洗（自來水）、浸泡（洗衣粉）、沖洗（自來水），烘干（50℃，恒溫干燥箱）酸泡（24小時，至少6小時）、清洗（流水沖洗和蒸溜水沖洗15遍以上），50℃烘干。新的橡膠制品洗滌方法0.5MNaOH煮沸15分鐘或浸泡過夜，流水沖洗，0.5MHCl煮沸15分鐘或浸泡過夜，流水沖洗，蒸餾水沖洗15次以上，50℃烤干備用。第16頁,共27頁，2024年2月25日，星期天消毒：消毒前常用的包裝：牛皮紙、棉布、鋁飯盒包裝高壓蒸汽消毒：121℃，維持20-30分鐘。第17頁,共27頁，2024年2月25日，星期天三：細(xì)胞培養(yǎng)方法1.細(xì)胞復(fù)蘇方法：從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴中，甩動凍存管，使其融化（1分鐘左右）；5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；1000轉(zhuǎn)低速離心5分鐘；去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。第18頁,共27頁，2024年2月25日，星期天2.細(xì)胞換液方法：換液指針：觀察培養(yǎng)基顏色：當(dāng)培養(yǎng)基的顏色由紅色漸漸褪成橙黃色，顏色清亮，無雜質(zhì)，無渾濁觀察細(xì)胞生長狀態(tài)：細(xì)胞生長狀態(tài)良好，確認(rèn)無細(xì)菌真菌污染換液方法：將吸管、廢液缸放入工作臺開啟細(xì)胞培養(yǎng)房及工作臺紫外消毒20分鐘，開啟恒溫水浴箱，培養(yǎng)液預(yù)熱關(guān)閉紫外燈，開啟工作臺上風(fēng)機(jī)吸棄原培養(yǎng)液加入新的培養(yǎng)第19頁,共27頁，2024年2月25日，星期天3.細(xì)胞傳代方法：傳代指針：觀察培養(yǎng)基顏色：當(dāng)培養(yǎng)基的顏色由紅色漸漸褪成橙黃色，顏色清亮，無雜質(zhì)，無渾濁顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)：細(xì)胞生長狀態(tài)良好，鋪滿培養(yǎng)瓶80%以上，細(xì)胞透亮，形態(tài)清晰，間隙無雜質(zhì)，確認(rèn)無細(xì)菌真菌污染第20頁,共27頁，2024年2月25日，星期天傳代方法：將新的培養(yǎng)皿、吸管、廢液缸放入工作臺開啟細(xì)胞培養(yǎng)房及工作臺紫外消毒20分鐘，開啟恒溫水浴箱，培養(yǎng)液、消化液預(yù)熱關(guān)畢紫外燈，開燈，通氣，點燃酒精燈吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗兩次加入2ml消化液晃動培養(yǎng)瓶使消化液覆蓋整個細(xì)胞界面后吸棄培養(yǎng)液肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部出現(xiàn)一層云霧狀，輕輕敲打底部有塊狀物脫落，顯微鏡下觀察看到細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞回縮變圓少量漂浮后加入10ml含血清培養(yǎng)基終止消化，吹打管吹打數(shù)次將細(xì)胞懸液吸至離心管，1000rpm離心5分鐘吸棄上清，加入PBS吹打混勻，1000rpm再次離心5分鐘吸棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基，吹打混勻，按比例接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶第21頁,共27頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞消化時間的控制：第22頁,共27頁，2024年2月25日，星期天4:細(xì)胞凍存：

吸出舊培養(yǎng)液加PBS沖洗兩次

胰酶消化

加培養(yǎng)基中止消化，（以上步驟同細(xì)胞傳代）細(xì)胞計數(shù)離心收集細(xì)胞，吸棄上清，加入凍存液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/ml將細(xì)胞移入凍存管，寫好標(biāo)簽（細(xì)胞種類，凍存時間）4℃15-30分鐘，-20℃1-2小時，-80℃保存，或過夜后至液氮罐內(nèi)保存。第23頁,共27頁，2024年2月25日，星期天5:細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)室構(gòu)造數(shù)紅色邊框標(biāo)記的四個方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)（如有壓線則計上不計下，計左不計右）細(xì)胞數(shù)/ml=（4個大方格細(xì)胞總數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)第24頁,共27頁，2024年2月25日，星期天四、細(xì)胞培養(yǎng)注意事項1.實驗進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射20-30分鐘滅菌，以75%酒精擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以75%酒精擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個細(xì)胞株之操作第25頁,共27頁，2024年2月25日，星期天2.

無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。容器、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿實驗用品以75%酒精擦拭外部后才帶入無菌操作