GB-T 42879-2023 化學(xué)品 新西蘭泥蝸（Potamopyrgus antipodarum）繁殖試驗(yàn)

化學(xué)品新西蘭泥蝸(Potamopyrgus2023-08-06發(fā)布國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局I前言 2規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 4試驗(yàn)原理 15受試物信息 26參比物 27方法描述 28試驗(yàn)程序 49質(zhì)量保證與質(zhì)量控制 610數(shù)據(jù)處理 7 7附錄A(資料性)新西蘭泥蝸的馴養(yǎng) 9附錄B(資料性)新西蘭泥蝸的圖片和軟體示意圖 附錄C(資料性)樣本數(shù)據(jù)記錄表 附錄D(資料性)時(shí)間-加權(quán)平均濃度的計(jì)算 參考文獻(xiàn) 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)危險(xiǎn)化學(xué)品管理標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC251)提出并歸口。本文件起草單位：廣東省科學(xué)院微生物研究所(廣東省微生物分析檢測(cè)中心)、生態(tài)環(huán)境部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、上海市檢測(cè)中心、廈門市格靈生物技術(shù)有限公司、生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所、沈化測(cè)試技術(shù)(南通)有限公司、中國(guó)化工信息中心有限公司、中國(guó)化工經(jīng)濟(jì)技術(shù)發(fā)展中心、浙江亞旺科技有限公司。本文件用于評(píng)價(jià)長(zhǎng)期暴露下化學(xué)品對(duì)新西蘭泥蝸(Potamopyrgusantipodarum)繁殖和生殖后代存活的潛在影響。關(guān)于軟體動(dòng)物毒性測(cè)試的綜述性論文強(qiáng)調(diào)了針對(duì)部分化學(xué)品開展水生軟體動(dòng)物繁殖毒性試驗(yàn)的必要性，特別強(qiáng)調(diào)了這類在生態(tài)和經(jīng)濟(jì)上具有重要地位的生物在毒性試驗(yàn)方法方面的缺失。試驗(yàn)暴露28d后，測(cè)定死亡率并以每只雌蝸所產(chǎn)的胚胎總數(shù)(不區(qū)分發(fā)育階段)來(lái)評(píng)價(jià)其繁殖量。如采用本方法對(duì)混合物開展測(cè)試并將獲得的數(shù)據(jù)用于監(jiān)管時(shí)，需考慮試驗(yàn)結(jié)果是否充分且有效。如有法規(guī)明確規(guī)定可對(duì)混合物進(jìn)行測(cè)試，則可直接采用本文件?；瘜W(xué)品新西蘭泥蝸(Potamopyrgus本文件描述了化學(xué)品新西蘭泥蝸繁殖試驗(yàn)的試驗(yàn)原理、受試物信息、參比物、方法描述、試驗(yàn)程序、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)和報(bào)告。本文件適用于化學(xué)品的新西蘭泥蝸繁殖試驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件?；瘜W(xué)品快速生物降解性呼吸計(jì)量法試驗(yàn)化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的MITI試驗(yàn)(I)化學(xué)品快速生物降解性DOC消減試驗(yàn)化學(xué)品快速生物降解性二氧化碳產(chǎn)生試驗(yàn)化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的OECD篩選試驗(yàn)3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。x%效應(yīng)濃度x%effectconcentration;ECx暴露期間引起新西蘭泥蝸繁殖量降低x%時(shí)的受試物濃度。暴露期間與對(duì)照相比，對(duì)受試生物產(chǎn)生顯著效應(yīng)(p<0.05)(繁殖量和死亡率)的最低受試物濃度。注：LOEC以上的所有試驗(yàn)濃度所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)等于或者顯著高于LOEC中所觀察到的毒性效應(yīng)。無(wú)可觀察效應(yīng)濃度noobservedeffectconcentration;NOEC在暴露期間與對(duì)照組相比，對(duì)受試生物未產(chǎn)生顯著效應(yīng)(p<0.05)的受試物濃度。受試生物停止活動(dòng)。注：用鑷子輕輕觸碰受試生物的蝸?zhàn)慊蛭伱?如果泥蝸縮進(jìn)蝸殼內(nèi))未見反應(yīng)，視為死亡。4試驗(yàn)原理試驗(yàn)主要目的是通過統(tǒng)計(jì)暴露28d結(jié)束后孵育囊中的胚胎數(shù)量(不區(qū)分發(fā)育階段)來(lái)評(píng)價(jià)化學(xué)品對(duì)新西蘭泥蝸繁殖量的影響。將蝸暴露于一定濃度范圍的受試物中進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)受試物為難測(cè)試化合物(如受試物為易揮發(fā)、不穩(wěn)定、可快速生物降解和吸附性物質(zhì))時(shí)，試驗(yàn)應(yīng)采用流水式試驗(yàn)來(lái)代替半靜態(tài)方式(見8.3),28d暴露期結(jié)束后考察蝸的存活率和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝸的繁殖情況。受試物對(duì)胚胎數(shù)量的毒性效應(yīng)以EC,或無(wú)可觀察效應(yīng)濃度和最低可觀察效應(yīng)濃度(NOEC/LOEC)來(lái)表征。受試物對(duì)胚胎數(shù)量的毒性效應(yīng)以EC,或無(wú)可觀察效應(yīng)濃度(NOEC)和最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)來(lái)表征，前者通過采用合適的回歸模型擬合后估算導(dǎo)致胚胎數(shù)量出現(xiàn)x%下降時(shí)的受試物濃度。試驗(yàn)濃度應(yīng)包括出現(xiàn)效應(yīng)的最低濃度(例如ECio),該濃度通過內(nèi)插法而非外推法得出。5受試物信息在試驗(yàn)前，應(yīng)掌握受試物的下列信息：a)結(jié)構(gòu)式；b)純度；c)光穩(wěn)定性；d)試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性；e)水解作用；f)解離常數(shù)(pKa);g)正辛醇/水分配系數(shù)(Pow);h)按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21856、GB/T21857測(cè)定的快速生物降解性；i)水中溶解度；j)蒸氣壓；k)受試物在水溶液中的定量分析方法、回收率和定量限。6參比物為確保受試生物和試驗(yàn)條件的一致性和敏感性，應(yīng)定期或在需要時(shí)開展參比物試驗(yàn)。已得到驗(yàn)證的參比物質(zhì)包括：氯化鎘、三丁基氯化錫(TBT-Sn)和咪鮮胺，其對(duì)以新西蘭泥蝸胚胎數(shù)量作為繁殖量(見8.6)的ECso范圍分別是5μg/L～20μg/L(以Cd計(jì))、35ng/L～190ng/L和100μg/L～800μg/L7.1儀器設(shè)備試驗(yàn)容器或其他與試驗(yàn)溶液接觸的器皿應(yīng)為全玻璃或其他化學(xué)惰性材料制成，測(cè)試過程中如使用塑料材質(zhì)的容器應(yīng)確保無(wú)增塑劑或其他化合物浸出。常用的儀器設(shè)備包括：a)用穿孔蓋或紗布覆蓋的500mL燒杯或其他可透氣的防止試驗(yàn)蝸逃逸的器具；b)空氣泵、空氣管和巴斯德管；c)用于氣流控制的可調(diào)節(jié)閥；d)用于配制溶液的容量瓶和其他玻璃器皿；e)玻璃移液管；f)溶解氧測(cè)定儀；2h)電導(dǎo)率儀；i)用于測(cè)量水中氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、總有機(jī)碳和水硬度的試劑盒或其他相關(guān)的設(shè)備；j)裝有光源的體視顯微鏡；k)用于控制溫度、光照的人工氣候室或空調(diào)室或其他合適的設(shè)備；1)解剖盤和解剖器械。7.2受試生物7.2.1試驗(yàn)以新西蘭泥蝸(Potamopyrgusantipodarum)為受試生物。用于驗(yàn)證試驗(yàn)的親蝸屬于單倍型t和形態(tài)型“WarwickA”,因此建議使用單倍型t和形態(tài)型“WarwickA”的親蝸進(jìn)行試驗(yàn)。單倍型t和形態(tài)型“WarwickA”具有明顯不同的遺傳和解剖標(biāo)記。7.2.2試驗(yàn)用蝸應(yīng)為實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)、取自同一群體的健康成蝸(即未表現(xiàn)任何受脅迫現(xiàn)象，如死亡率高、繁殖力差和寄生蟲感染等)。親蝸應(yīng)在相同的環(huán)境條件(光照、溫度、培養(yǎng)基和喂食)下進(jìn)行馴養(yǎng)(新西蘭泥蝸的馴養(yǎng)見附錄A)。如通過市售購(gòu)買親蝸，獲得后至少需開展2周的試驗(yàn)前馴養(yǎng)以避免生物受到脅迫。由于不清楚泥蝸的(污染)歷史，不宜采用野外獲得的蝸開展試驗(yàn)。7.3配制水(合成水)/試驗(yàn)培養(yǎng)基7.3.1應(yīng)使用配制水作為唯一的試驗(yàn)培養(yǎng)基。將3g海鹽(或等效海鹽)和1.8g碳酸氫鈉溶解于10L去離子水中配制成配制水(合成水)。配制水(即添加飼料之前)中總有機(jī)碳質(zhì)量濃度應(yīng)小于2mg/L,應(yīng)在惰性材料(如玻璃或不銹鋼)的容器中制備，而且容器的容積需足夠大，例如50L玻璃缸，制成后儲(chǔ)存?zhèn)溆?。配制水宜在黑暗中室溫保存，并?周內(nèi)使用，使用前應(yīng)至少曝氣24h。7.3.2配制水應(yīng)符合下列水質(zhì)參數(shù)要求：b)氧飽和度：大于空氣飽和值的60%;d)總有機(jī)碳：小于2mg/L。7.3.3試驗(yàn)容器盛裝400mL的配制水，用穿孔蓋或紗布覆蓋確保與外部保持空氣流通。玻璃燒杯應(yīng)每周更換?？蓪⒏髌叫械娜芤夯旌虾蠓治鍪茉囄餄舛?，有時(shí)為了滿足分析要求可能需要制備更大容量的試驗(yàn)液。7.4試驗(yàn)溶液7.4.1通過稀釋貯備液得到不同濃度的試驗(yàn)溶液。采用攪拌、超聲波處理或其他適當(dāng)?shù)姆椒?，將受試物溶解于配制水?lái)制備貯備液，盡量避免使用助溶劑或分散劑。對(duì)于難測(cè)試化學(xué)物質(zhì)可參考文獻(xiàn)。如果使用助溶劑以配制適當(dāng)濃度和均勻的貯備液，其最終濃度應(yīng)盡可能低，且不應(yīng)超過20μL/L。除了配制水對(duì)照組外，應(yīng)增設(shè)一個(gè)助溶劑對(duì)照組。在所有的試驗(yàn)濃度組和助溶劑對(duì)照組中，助溶劑的濃度應(yīng)保持相同。7.4.2根據(jù)受試物的物理化學(xué)性質(zhì)和試驗(yàn)敏感性選擇合適的助溶劑，助溶劑應(yīng)在試驗(yàn)的前期確定。所用的助溶劑和分散劑應(yīng)對(duì)親蝸的繁殖無(wú)明顯效應(yīng)。對(duì)于助溶劑的選擇，可以參考關(guān)于難測(cè)試化學(xué)物質(zhì)毒性測(cè)試的文獻(xiàn)。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，使用的助溶劑包括二甲基亞砜(DMSO)、三乙二醇(TEG)、丙酮和冰醋酸。二甲基亞砜、三乙二醇和丙酮的特點(diǎn)是毒性低(對(duì)親蝸的NOEC≥12.5mL/L,至少高于助溶劑在試驗(yàn)中最高濃度20μL/L的625倍),而且不會(huì)在試驗(yàn)容器中形成生物膜。相反，使用乙醇作為助溶劑，即使當(dāng)濃度低至30μL/L時(shí)也會(huì)導(dǎo)致真菌和細(xì)菌的大量繁殖。38試驗(yàn)程序8.1暴露條件試驗(yàn)周期為28d。8.1.2.1應(yīng)檢查用于試驗(yàn)的親蝸繁殖能力。試驗(yàn)前從用于試驗(yàn)的培養(yǎng)批次中挑選20只親蝸，測(cè)定其外殼長(zhǎng)度和胚胎數(shù)量(參見附錄B的圖B.1)。親蝸的外殼長(zhǎng)度應(yīng)為3.5mm～4.5mm,每只親蝸平均產(chǎn)胚胎數(shù)量在5～20之間，即為實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期培養(yǎng)的親蝸繁殖胚胎的上限和下限(參見附錄A)。平均胚胎數(shù)量的變異系數(shù)不應(yīng)超過40%。8.1.2.2用鑷子將6只成齡親蝸隨機(jī)分配到各個(gè)盛有受試物溶液的試驗(yàn)容器中。容器應(yīng)隨機(jī)擺放，例如按隨機(jī)分組表進(jìn)行擺放，以減少試驗(yàn)位置帶來(lái)的影響，否則可能造成偏差，這種偏差可能歸因于濃度導(dǎo)致的效應(yīng)。尤其是如果按照不同組別或濃度順序來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)單元的操作，則易出現(xiàn)某些與時(shí)間順序相關(guān)的效應(yīng)，例如疲勞操作或其他錯(cuò)誤，易導(dǎo)致濃度越高的試驗(yàn)組效應(yīng)越明顯。宜每天喂食，至少每周3次喂食細(xì)碎的市售飼料[60μg/(蝸·d)～80μg/(蝸·d)],喂食頻次和數(shù)量應(yīng)在報(bào)告中注明。用去離子水或者蒸餾水制備均勻的飼料懸濁液，采用不斷攪拌的方式避免飼料顆粒沉淀，將適量的懸浮飼料轉(zhuǎn)移到各個(gè)試驗(yàn)容器中。添加到每個(gè)濃度組的飼料懸濁液體積應(yīng)盡可能小，以減少對(duì)試驗(yàn)溶液的稀釋。飼料應(yīng)即配即用。試驗(yàn)過程中，每天光暗比為16h:8h,試驗(yàn)溶液表面的光照強(qiáng)度為5001x±100lx。如果進(jìn)行光敏感的受試物試驗(yàn)，應(yīng)降低光照強(qiáng)度。光源應(yīng)安裝在試驗(yàn)容器的上方，試驗(yàn)容器應(yīng)放置于深色的臺(tái)面上避免親蝸逃逸。光照條件的偏離應(yīng)在報(bào)告中說(shuō)明理由。試驗(yàn)過程中，應(yīng)控制試驗(yàn)溶液的溫度為16℃±1.5℃。8.1.6.1通過連接到空氣管道系統(tǒng)的玻璃管(巴斯德管)對(duì)試驗(yàn)溶液進(jìn)行曝氣，使用流量閥控制曝氣強(qiáng)度。如果受試物為揮發(fā)性化合物，不宜進(jìn)行曝氣。對(duì)于易揮發(fā)的物質(zhì)應(yīng)采用容積足夠大且完全充滿試驗(yàn)溶液的密閉容器進(jìn)行測(cè)試，以避免氧氣不足。8.1.6.2溶解氧含量應(yīng)維持大于空氣飽和度的60%,并輕輕充氣以免受試物揮發(fā)。8.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)8.2.1正式試驗(yàn)正式試驗(yàn)至少設(shè)置5個(gè)受試物試驗(yàn)濃度組，每個(gè)濃度組包含6個(gè)平行，每個(gè)平行放入6只親蝸(即每濃度組36只親蝸)。試驗(yàn)濃度可按幾何數(shù)列設(shè)置，間隔系數(shù)不超過3.2。如果少于5個(gè)濃度組和/或者濃度間距大于3.2應(yīng)作說(shuō)明(例如以通過預(yù)試驗(yàn)的濃度效應(yīng)曲線進(jìn)行解釋)。通過預(yù)試驗(yàn)或者其他來(lái)4源如交叉參照等獲知的受試物毒性信息，有助于選擇合適的試驗(yàn)濃度范圍。試驗(yàn)的最高濃度不應(yīng)高于受試物的飽和溶解度。試驗(yàn)宜設(shè)置5個(gè)(或更多)濃度組，每個(gè)濃度組6個(gè)平行，以同時(shí)獲得EC,以及NOEC/LOEC。預(yù)期毒性值應(yīng)在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，如需計(jì)算EC,理想狀況下EC,應(yīng)在設(shè)置的試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)。如果預(yù)試驗(yàn)表明在最高濃度(10mg/L受試物溶液或者飽和溶液)中未觀察到效應(yīng)，或者受試物的毒性效應(yīng)非常低，可設(shè)置一個(gè)試驗(yàn)濃度組，如10mg/L和空白對(duì)照組進(jìn)行限度試驗(yàn)。10mg/L組和空白對(duì)照組均設(shè)置10個(gè)平行，每個(gè)平行6只親蝸。限度試驗(yàn)有可能會(huì)顯示在限定濃度時(shí)無(wú)明顯的效應(yīng)，但當(dāng)限度試驗(yàn)產(chǎn)生效應(yīng)濃度時(shí)，則需開展完整的正式試驗(yàn)。試驗(yàn)少于10個(gè)平行應(yīng)說(shuō)明理由。不含受試物的空白對(duì)照組試驗(yàn)中應(yīng)包括適當(dāng)數(shù)量的平行。配制水空白對(duì)照組平行數(shù)為6個(gè)，需要時(shí)還應(yīng)增設(shè)助溶劑對(duì)照組(僅含有助溶劑)6個(gè)平行。如果試驗(yàn)為限度試驗(yàn)，空白對(duì)照組應(yīng)增加到10個(gè)平行(見8.2.2)。8.3試驗(yàn)溶液的更換8.3.1溶液的更換頻率取決于受試物的穩(wěn)定性，但至少每周3次。燒杯應(yīng)每周更換。如果初步的穩(wěn)定性試驗(yàn)或者受試物的理化性質(zhì)表明受試物不穩(wěn)定(即超出配制濃度的80%～120%或低于初始測(cè)定濃度的80%),受試物在最長(zhǎng)的更換周期內(nèi)(即3d)不穩(wěn)定，宜增加更換頻率。例如受試物為難測(cè)試物質(zhì)(即易揮發(fā)、不穩(wěn)定、可快速生物降解和吸附性化合物)時(shí)，則宜進(jìn)行流水式試驗(yàn)。試驗(yàn)程序已在半靜態(tài)試驗(yàn)的條件下通過驗(yàn)證，流水式試驗(yàn)也可采用該程序，但應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整并予以說(shuō)明。8.3.2試驗(yàn)溶液的更換可參考以下流程。輕輕地將試驗(yàn)容器中的暴露溶液完全移出，用篩網(wǎng)收集可能從玻璃壁上脫落的親蝸，篩網(wǎng)收集到的親蝸應(yīng)盡快放回試驗(yàn)容器。在試驗(yàn)溫度下將配制水重新注入試驗(yàn)容器，立即將受試物(例如采用貯備液)添加到更換的配制水中。對(duì)新制備的暴露試驗(yàn)溶液進(jìn)行人工攪拌使之均勻，然后將親蝸重新放回試驗(yàn)容器中。一旦完成對(duì)照組和試驗(yàn)溶液更換，立即給受試生物飼喂定量(見8.1.3)的飼料。8.4試驗(yàn)觀察每周至少觀察試驗(yàn)容器3次，對(duì)任何異常行為進(jìn)行目測(cè)評(píng)估(如浮出水面、拒食或嗜睡，即完全縮進(jìn)蝸殼內(nèi)靜止不動(dòng)或?qū)⑽佔(zhàn)闵斐鑫仛げ⑻与x試驗(yàn)容器),宜在更新試驗(yàn)溶液和其后喂食期間，觀察受試生物的脅迫情況，任何脅迫情況都應(yīng)記錄下來(lái)。如果發(fā)現(xiàn)親蝸逃離對(duì)照和試驗(yàn)溶液，應(yīng)馬上將其轉(zhuǎn)移回溶液中。受試生物停止活動(dòng)，即用鑷子輕輕觸碰受試生物的蝸?zhàn)慊蛭佅?蝸縮進(jìn)蝸殼內(nèi)時(shí))也未見反應(yīng)，視為死亡。宜每天或至少在溶液更新時(shí)將死亡的親蝸從試驗(yàn)容器中移出，并進(jìn)行記錄。8.6.1試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，統(tǒng)計(jì)所有存活蝸孵育囊中胚胎的數(shù)量。宜將蝸快速冷凍(在液氮或一80℃的超低溫冰箱中),并貯存在一20℃直至分析計(jì)數(shù)。如做組織病理學(xué)的檢查，則需在解剖前將蝸置于用去離子水或蒸餾水配制的2.5%六水合氯化鎂(MgCl?·6H?O)溶液中麻醉45min～90min。8.6.2蝸殼的長(zhǎng)度(從殼尖至蝸口的下邊緣，見圖B.1)應(yīng)在體視顯微鏡下用目鏡的測(cè)微尺進(jìn)行測(cè)量。5殼長(zhǎng)與雌蝸的繁殖能力呈正相關(guān)，可作為一個(gè)輔助性的指標(biāo)。8.6.3用鉗子小心地將蝸殼弄破，然后將蝸置于有少量試驗(yàn)用水或自來(lái)水的解剖盤中。用解剖針或尖的鑷子將殼移除，獲得蝸的軟體，透過上皮可以很容易地觀察到蝸的胚胎(見圖B.2和圖B.3)。用解剖針小心打開蝸的孵育囊，然后將胚胎(包括帶殼的和無(wú)殼的)移出和計(jì)數(shù)，以計(jì)算每只雌性蝸的繁殖成功率(見圖B.4)。8.6.4如果受試蝸未產(chǎn)出胚胎，則需鑒定其性別。雄性蝸的特征是在頸部有雄性生殖器(在吻和兩個(gè)觸須后的外套腔的底部)。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的單倍型蝸t中從未出現(xiàn)過雄性蝸，出現(xiàn)雄性蝸對(duì)繁殖試驗(yàn)結(jié)果的影響尚未清楚。假如在試驗(yàn)中出現(xiàn)了雄性蝸，則應(yīng)將其從繁殖能力的統(tǒng)計(jì)分析中剔除。8.6.5數(shù)據(jù)應(yīng)記錄在合適的數(shù)據(jù)記錄表(見附錄C的范例)中，計(jì)算殼長(zhǎng)和胚胎數(shù)量的平均值及其變異系數(shù)，例如標(biāo)準(zhǔn)偏差或標(biāo)準(zhǔn)誤差。8.7.1受試物的濃度8.7.1.1試驗(yàn)期間定期測(cè)定受試物的濃度。應(yīng)建立濃度分析方法，包括合適的定量限和受試物在試驗(yàn)體系中的穩(wěn)定性信息。8.7.1.2在半靜態(tài)試驗(yàn)中，受試物的濃度預(yù)計(jì)能維持在理論濃度的±20%的范圍內(nèi)(即在80%～120%范圍內(nèi)，見8.3),在更換溶液時(shí)應(yīng)至少測(cè)定最高和最低濃度組中新舊試驗(yàn)溶液中的受試物濃度。分析測(cè)定的樣品應(yīng)來(lái)自同一試驗(yàn)溶液，包括新舊溶液。此后應(yīng)至少每周重復(fù)測(cè)定。8.7.1.3如果預(yù)計(jì)受試物濃度不能維持在理論濃度的士20%的范圍內(nèi)，則需要測(cè)定所有試驗(yàn)組新、舊試驗(yàn)溶液的受試物濃度。但是，在受試物的初始實(shí)測(cè)濃度不在理論濃度的±20%范圍時(shí)，如有足夠的證據(jù)表明受試物的初始實(shí)測(cè)濃度重復(fù)性好且穩(wěn)定(即在初始濃度的80%～120%范圍內(nèi)),那么第2周、第3周和第4周受試物的濃度分析可減少為僅測(cè)定最高和最低濃度試驗(yàn)組。受試物濃度的測(cè)定應(yīng)在同一試驗(yàn)組的不同平行容器中交替進(jìn)行，任何情況下，僅需測(cè)定其中一個(gè)平行容器中受試物的濃度。8.7.1.4與半靜態(tài)試驗(yàn)類似的采樣策略同樣適用于流水式試驗(yàn)(只是“舊溶液”的測(cè)定不適用于流水式試驗(yàn))。但在試驗(yàn)的第1周應(yīng)增加采樣的次數(shù)(至少測(cè)定2次),這有利于證明受試物濃度保持穩(wěn)定。在正式試驗(yàn)開始之前需要完成濃度穩(wěn)定性的驗(yàn)證工作。在流水式試驗(yàn)中，每天都應(yīng)檢查稀釋水和受試物貯備液的流速。8.7.1.5如有證據(jù)表明在整個(gè)試驗(yàn)期間，受試物濃度始終維持在理論濃度或?qū)崪y(cè)初始濃度的±20%范圍內(nèi)，可以理論濃度或?qū)崪y(cè)初始濃度表示試驗(yàn)結(jié)果。如果受試物濃度的變化超過了理論濃度或?qū)崪y(cè)初始濃度的士20%范圍，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)以時(shí)間-加權(quán)平均濃度表示(計(jì)算方法見附錄D)。8.7.2物理化學(xué)參數(shù)應(yīng)至少每周測(cè)定一次空白對(duì)照組和每個(gè)受試物試驗(yàn)組中某個(gè)平行容器中新、舊溶液的水質(zhì)參數(shù)，包括pH、溶解氧、電導(dǎo)率、溫度、氨氮和亞硝酸鹽濃度。如果空白對(duì)照組或最低濃度試驗(yàn)組中出現(xiàn)異常高的死亡率，則需增加測(cè)定硝酸鹽和總硬度的濃度。9質(zhì)量保證與質(zhì)量控制如滿足以下條件，試驗(yàn)結(jié)果有效：a)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空白對(duì)照組所有重復(fù)的平均死亡率不超過20%;b)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空白對(duì)照組中每個(gè)親蝸所產(chǎn)的平均胚胎數(shù)不少于5個(gè)；c)試驗(yàn)期間，空白對(duì)照組和暴露組的溶解氧含量不低于空氣飽和值的60%;67d)試驗(yàn)期間，空白對(duì)照組和暴露組的平均水溫在16℃±1.5℃范圍內(nèi)。10.1.1試驗(yàn)?zāi)康氖窃u(píng)價(jià)受試物對(duì)繁殖量的影響。28d暴露試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用表格的形式(見附錄C的示例)列出存活的親蝸及其孵育囊中胚胎(不考慮發(fā)育階段的差別)的數(shù)量。計(jì)算每個(gè)試驗(yàn)組所有平行所產(chǎn)胚胎數(shù)量的平均值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在繁殖試驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)的濃度-效應(yīng)關(guān)系是產(chǎn)胚胎數(shù)量的平均值隨著受試物濃度的增加而下降。繁殖試驗(yàn)已通過化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)化學(xué)物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致胚胎數(shù)量減少。試驗(yàn)中也可能會(huì)出現(xiàn)繁殖量增加的情況，這種情況已在乙醇和其他一些已知或疑似對(duì)脊椎動(dòng)物有雌激素效應(yīng)的物質(zhì)的繁殖試驗(yàn)中觀察到。但是本繁殖試驗(yàn)不適用于僅僅根據(jù)胚胎數(shù)量的增減證明內(nèi)分泌的介導(dǎo)作用。10.1.2在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如方差檢驗(yàn)、比較受試物試驗(yàn)組與空白對(duì)照組的Dunnett's檢驗(yàn)、Williams’檢驗(yàn)或Jonckheere-Terpstra遞減趨勢(shì)檢驗(yàn)(見10.3.2)前，如果需要滿足特定統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的要求，宜將數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。如果采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法，可考慮根據(jù)Holm或Jonckheere-Terpstra趨勢(shì)檢驗(yàn)得到的Bonferroni-U檢驗(yàn)方法，可用各受試物試驗(yàn)組的平均值計(jì)算95%的置信限。另外，含有Poisson或負(fù)二項(xiàng)誤差分布的廣義線性混合模型(GLMM)也可用于胚胎數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分析。10.1.3空白對(duì)照組存活親蝸的數(shù)量是試驗(yàn)有效性指標(biāo)之一，應(yīng)予以記錄和報(bào)告。所有其他的負(fù)面效應(yīng)也應(yīng)在最終報(bào)告中進(jìn)行描述，如異常行為(浮出水面、拒食或嗜睡，即完全縮進(jìn)殼內(nèi)靜止不動(dòng)或?qū)⑽佔(zhàn)闵斐鑫仛げ⑻与x試驗(yàn)容器)和胚胎的異常外觀(如沒有殼的已完全發(fā)育的胚胎、帶畸形殼的胚胎)。對(duì)采用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，如泊松誤差分布邏輯模型，計(jì)算EC,及其95%的置信限范圍。需注意的是，Weibull和Spearman-Karber檢驗(yàn)是在非連續(xù)效應(yīng)時(shí)使用的，如固定數(shù)量受試生物受到脅迫時(shí)的存活率。這與繁殖不同，對(duì)于繁殖，胚胎的數(shù)量是因親本的不同而變化。有時(shí)也將這些非連續(xù)效應(yīng)作為帶有正態(tài)誤差的連續(xù)效應(yīng)進(jìn)行分析，但針對(duì)不同的情況應(yīng)仔細(xì)評(píng)估。為了計(jì)算EC?、EC?或其他EC,,應(yīng)采用回歸分析模型分析所有的數(shù)據(jù)。10.3.1如果統(tǒng)計(jì)NOEC或LOEC,應(yīng)根據(jù)參考文獻(xiàn)選用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。通常采用單邊假設(shè)檢驗(yàn)(p<0.05)比較受試物試驗(yàn)組與空白對(duì)照組的毒性效應(yīng)，但參考文獻(xiàn)未覆蓋非正態(tài)誤差分布的GLMM10.3.2正態(tài)分布和方差齊性可用合適的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，如分別用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)(p<0.05)和Levene檢驗(yàn)(p<0.05)。如果使用GLMM模型，應(yīng)檢查過度分散(額外泊松變率),選擇如負(fù)二項(xiàng)誤差分布代替Poisson誤差分布，然后進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。多重比較(如Dunnett'stest)或step-down趨勢(shì)檢驗(yàn)(如Williams’檢驗(yàn)或Jonckheere-Terpstra遞減趨勢(shì)檢驗(yàn))均可用于計(jì)算受試物試驗(yàn)組與空白對(duì)照組之間是否存在顯著性差異(p<0.05)(根據(jù)參考文獻(xiàn)選擇推薦的檢驗(yàn)方法)。此外，非參數(shù)檢驗(yàn)方法(如根據(jù)Holm或Jonckheere-Terpstr趨勢(shì)檢驗(yàn)得到的Bonferroni-U檢驗(yàn))也可以用于確11報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容。8a)受試物：——單組分物質(zhì)：物理性狀、水溶解性，其他相關(guān)的物理-化學(xué)特性；化學(xué)特性鑒定，如IUPAC的化學(xué)鑒別信息(必要時(shí)包括有機(jī)碳含量);——多組分物質(zhì)、UVCBs(成分未知或組分多變的物質(zhì)、復(fù)雜反應(yīng)產(chǎn)物或生物材料)和混合物：盡可能提供各組分的化學(xué)鑒別信息(同單組分物質(zhì))、含量和相關(guān)的物理-化學(xué)特性。 合適的受試物定量分析方法。b)受試生物：學(xué)名、供應(yīng)商或來(lái)源和飼養(yǎng)條件。c)試驗(yàn)條件：——使用的試驗(yàn)程序(如半靜態(tài)或流水式、體積、每升試驗(yàn)溶液中蝸的承載量);——光周期和光照強(qiáng)度；——試驗(yàn)設(shè)計(jì)(如使用的試驗(yàn)濃度、平行的數(shù)量和每個(gè)平行中蝸的數(shù)量等);——受試物的預(yù)處理、添加或使用方法；——理論試驗(yàn)濃度、濃度分析樣品采集方法和受試物濃度分析方法的詳細(xì)信息；——試驗(yàn)溶液的水質(zhì)指標(biāo)(即pH、電導(dǎo)率、溫度、氧飽和度、氨氮、亞硝酸鹽濃度、總有機(jī)碳濃度和其他測(cè)試指標(biāo)); 飼喂的詳細(xì)信息(例如食物的類型、來(lái)源、投餌量和投餌頻率),——與受試物穩(wěn)定性相關(guān)的所有預(yù)試驗(yàn)結(jié)果；——各試驗(yàn)組的理論濃度和各試驗(yàn)容器中受試物的所有實(shí)測(cè)濃度結(jié)果，分析方法的回收率、實(shí)測(cè)值的平均值和檢出限也應(yīng)報(bào)告；——試驗(yàn)溶液的水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(如pH、溫度、溶解氧、氨氮和亞硝酸鹽濃度(見附錄C的示例表格);——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各平行胚胎數(shù)量的完整記錄(見附錄C的示例表格);——試驗(yàn)過程中蝸的死亡數(shù)量(見附錄C的示例表格);——如適用，應(yīng)報(bào)告繁殖的最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)和無(wú)可觀察效應(yīng)濃度(NOEC),包括采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的描述和預(yù)判毒性效應(yīng)范圍的依據(jù)(應(yīng)在試驗(yàn)開始前進(jìn)行全面的分析),如適用，也應(yīng)報(bào)告親蝸死亡率的LOEC和NOEC;——如適用，繁殖量的EC,和置信區(qū)間(如95%)以及適合用于計(jì)算的模型曲線；濃度-效應(yīng)的斜率及其置信區(qū)間；——其他可觀察或測(cè)定的生物學(xué)效應(yīng)：記錄任何其他可觀察或測(cè)定的生物學(xué)效應(yīng)(親蝸的異常行為見8.4,胚胎的異常外觀見10.1.3,以及對(duì)親蝸的生長(zhǎng)效應(yīng)),并加以合理解釋；——對(duì)本文件偏離的解釋說(shuō)明。9(資料性)新西蘭泥蝸的馴養(yǎng)A.1概述本附錄描述了實(shí)驗(yàn)室新西蘭泥蝸的馴養(yǎng)程序。淡水蝸的死亡率應(yīng)處于一個(gè)較低水平且不超過20%,平均每個(gè)泥蝸的胚胎數(shù)為5～20。應(yīng)為受試生物提供良好的飼料，且其群體密度不應(yīng)超過規(guī)定的數(shù)值。A.2試驗(yàn)生物A.2.1分類地位A.2.2生活習(xí)性新西蘭泥蝸原產(chǎn)于新西蘭，現(xiàn)分布于世界各地。其典型的棲息地包括諸如小溪、河流、湖泊、河口等流動(dòng)水體，在這些區(qū)域新西蘭泥蝸的繁殖通常十分密集。成齡泥蝸的平均體長(zhǎng)為3.5mm～4.5mm。新西蘭泥蝸主要生活在淡水中，在鹽含量≤15‰的半咸水中也可以存活和繁殖。新西蘭泥蝸喜歡生活在靜止或者緩慢流動(dòng)水體的灘涂上以及在海岸的河口地區(qū)，以水體中的植物、巖石或?yàn)┩勘砻娴脑孱?、巖屑和細(xì)菌為生。A.2.3生物學(xué)特性A.2.3.1在新西蘭泥蝸的原始分布地區(qū)，它的雌雄比例幾乎平衡，同時(shí)存在雌雄同體和單性群體。在其他地方，種群幾乎全部由單性繁殖的雌性蝸組成，通過這種方式，單個(gè)的新西蘭泥蝸就可以構(gòu)建一個(gè)完整的群體。在歐洲，雄性蝸很少被發(fā)現(xiàn)，并且在實(shí)驗(yàn)室的長(zhǎng)期飼養(yǎng)過程中也從未沒有出現(xiàn)過雄性蝸。根據(jù)相關(guān)研究，用于驗(yàn)證試驗(yàn)的新西蘭泥蝸屬于單倍型t和形態(tài)型“WarwickA”。A.2.3.2新西蘭泥蝸全年可繁殖，表現(xiàn)出一種非常獨(dú)特的孵育現(xiàn)象。卵在輸卵管的前端形成后轉(zhuǎn)入孵卵囊中。成熟的胚胎位于孵卵囊的前端，未成熟的胚胎位于孵卵囊的后端。當(dāng)卵殼破裂，胚胎通過生殖孔排出。新西蘭泥蝸的這種繁殖方式被稱為卵胎生。A.3.1溫度和光照條件新西蘭泥蝸的飼養(yǎng)應(yīng)在水溫16℃±1.5℃范圍內(nèi)、光照和黑暗時(shí)間比為16h:8h、光照強(qiáng)度為500lx±100lx的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。A.3.2飼養(yǎng)缸及輔助設(shè)備需要下列儀器設(shè)備：a)飼養(yǎng)缸(1.5L;玻璃制品);b)飼養(yǎng)液貯存缸(50L的玻璃缸);c)空氣泵；d)柔性通氣管(特氟龍涂層);e)移液管；g)水中氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽測(cè)定試劑盒；h)體視顯微鏡；i)冷光源；j)解剖盤和解剖儀器。A.3.3水調(diào)節(jié)用化學(xué)試劑、飼料和產(chǎn)品需要下列化學(xué)試劑和產(chǎn)品：a)固體碳酸氫鈉(NaHCO?);b)鈣源(例如墨魚骨或碳酸鈣);c)MgCl?·6H?O(如需要麻醉進(jìn)行后續(xù)組織病理學(xué)檢查);d)商用海鹽或者等效海鹽；e)商用飼料薄片或養(yǎng)分相同的飼料。新西蘭泥蝸采用配制水飼養(yǎng)，配制水由3g商用海鹽或等效海鹽和1.8g碳酸氫鈉溶解于10L的去離子水中配制而成。配制水于50L玻璃缸中制備并儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?chǔ)存時(shí)間最多不超過2周。該配制水使用之前至少進(jìn)行24h曝氣。水質(zhì)參數(shù)要求如下：b)氧氣飽和度：大于空氣飽和度的60%;配制水倒入飼養(yǎng)缸之前，應(yīng)檢查上述參數(shù)的符合性。A.4.2群體密度新西蘭泥蝸的群體密度不超過100只/L。A.4.3飼料和喂養(yǎng)將商用飼料薄片細(xì)磨后或者用等量的含有同樣養(yǎng)分的飼料進(jìn)行喂食。宜每天喂食，喂食頻率至少3次/周。薄片可以用瓷研缽進(jìn)行研磨或者帶有優(yōu)質(zhì)鋼攪拌機(jī)的咖啡磨進(jìn)行粉碎處理。A.4.4清潔和養(yǎng)護(hù)氨氮和亞硝酸鹽濃度的測(cè)定。如有必要，也可進(jìn)行硝酸鹽測(cè)定。A.4.4.2每周應(yīng)對(duì)部分飼養(yǎng)液進(jìn)行一次更換，更換量至少50%。飼養(yǎng)液更換時(shí)應(yīng)從容器中取出殘留飼料和碎屑，應(yīng)注意確保新西蘭泥蝸的幼體不會(huì)從玻璃缸中被移走。部分飼養(yǎng)液后應(yīng)對(duì)每一個(gè)正在飼養(yǎng)泥蝸的玻璃缸補(bǔ)充鈣源(如一片墨魚骨)。為了防止疾病和病原體的傳播，在對(duì)下一個(gè)正在試驗(yàn)的玻璃缸進(jìn)行參數(shù)測(cè)量之前，應(yīng)對(duì)放入玻璃缸中的電極進(jìn)行徹底清洗。A.4.5每月的胚胎數(shù)量的登記每個(gè)月應(yīng)對(duì)20只成齡新西蘭泥蝸(>3.5mm)的繁殖量進(jìn)行登記，同時(shí)測(cè)定泥蝸的體長(zhǎng)。步驟如下：a)對(duì)泥蝸進(jìn)行速凍(用液氮或者一80℃冰箱),分析之前儲(chǔ)存于一20℃冰箱中，只有當(dāng)泥蝸進(jìn)行病理組織學(xué)檢查時(shí)，才能選擇性地進(jìn)行麻醉(至少45min,但不超過90min),麻醉劑為用去離子水或蒸餾水配制的濃度為2.5%的MgCl?·6H?O溶液；b)泥蝸的體長(zhǎng)用帶目鏡測(cè)微尺的體視顯微鏡進(jìn)行測(cè)量并記錄；c)用鑷子輕輕地將泥蝸的殼破開，然后將蝸放置于有少量飼養(yǎng)液的解剖盤上；d)用解剖針或尖銳的鑷子移去蝸的外殼，獲得泥蝸的軟體(見圖B.1、圖B.2和圖B.4);e)用解剖針將泥蝸的孵育囊打開，把所有的胚胎從孵育囊內(nèi)取出；f)對(duì)所有的胚胎進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并記錄，計(jì)算泥蝸的體長(zhǎng)和胚胎數(shù)量平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)誤差。A.4.6藻類生長(zhǎng)、染病和死亡A.4.6.1如果泥蝸的殼表面出現(xiàn)大量藻類生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行人工移除。如果上述處理還無(wú)法減少藻類的增長(zhǎng)，應(yīng)將受到污染的泥蝸移出該蝸群，并對(duì)玻璃缸進(jìn)行徹底的清洗。A.4.6.2一旦發(fā)現(xiàn)有死亡的蝸宜盡快移出玻璃缸。如果在玻璃缸內(nèi)出現(xiàn)大量的泥蝸死亡(>20%),應(yīng)對(duì)整個(gè)玻璃缸中的蝸群觀察幾天。如果發(fā)現(xiàn)死亡率持續(xù)較高，應(yīng)終止所有泥蝸的馴養(yǎng)，并對(duì)玻璃缸以及所有的設(shè)備進(jìn)行徹底清潔和消毒。(資料性)新西蘭泥蝸的圖片和軟體示意圖新西蘭泥蝸的圖片見圖B.1、圖B.2和圖B.4,移除外殼的新西蘭泥蝸軟體示意圖見圖B.3。圖B.1帶殼的新西蘭泥蝸圖片圖B.2部分去殼的新西蘭泥蝸和裸露的孵育卵(白色)圖片圖B.3移除外殼的新西蘭泥蝸軟體示意圖從孵育卵里取出的胚胎圖片GBGB/T42879-2023樣本數(shù)據(jù)記錄表新西蘭泥蝸繁殖試驗(yàn)飼養(yǎng)液更換、物理和化學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)以及喂食樣本數(shù)據(jù)記錄表可參考表C.1范例進(jìn)行記錄。表C.1